• #pragma keywords biotechnologia

#pragma language pl

Powstawanie limfocytów Tc

Efektorowe limfocyty T mogą różnicować do trzech funkcjonalnych klas komórek pod wpływem roznych antygenów znajdujących się na powierzchni komórki docelowej. Antygeny pochodzące od bakterii wewnątrzkomórkowych są transportowane na powierzchnię komórki przez cząsteczki MHC klasy I i są prezentowane dla limfocytów T CD8. Komórki te różnicują do limfocytów cytotoksycznych. Mają zdolność do swoistego rozpoznawania i wybiórczego degradowania komórek docelowych w odróżnieniu do cytotoksycznych makrofagów i granulocytów, które oddziaływują z komórkami nieswoiście. Odgrywają one kluczowa rolę w odpowiedzi immunologicznej przeciwko patogenom wewnątrzkomórkowym (np. przeciwko wirusom, pierwotniakom), jak również w mniejszym stopniu biorą udział w zabijaniu komórek nowotworowych, komórek pochodzących z przeszczepów allogenicznych, a nawet niektórych wolno żyjących bakterii.

Rysunek 1. powstawanie limfocytów Tc

Limfocyty cytotoksyczne indukują proces apoptotyczny w komórce docelowej . Jest to możliwe dzięki wykorzystaniu dwóch podstawowych mechanizmów cytotoksyczności. Pierwszym z nich jest mechanizm związany z wydzieleniem z komórki zawartości ziaren cytotoksycznych, natomiast drugim jest mechanizm związany z aktywacją swoistych receptorów dla cząsteczek należących do nadrodziny TNF, które znajdują się na komórkach docelowych.

• Rysunek 2. Działanie limfocytów Tc na komórkę

REAKCJA CYTOTOKSYCZNA ZALEŻNA OD ZIAREN CYTOLITYCZNYCH

1) Rozpoznanie i związanie komórki docelowej przez limfocyt

Do połączenia komórki limfocytu Tc z komórką docelową dochodzi głównie dzięki interakcjom miedzy cząsteczkami adhezyjnymi, które występują na obydwu typach komórek. Znane są specyficzne pary receptor- ligand występujące na komórce efektorowej i docelowej takie jak:

• LFA-1 – ICAM-1 (LFA - lymphocyte function-associated antygen jest łańcuchem β2 integryny, której ekspresja zachodzi we wszystkich komórkach T) Cząsteczki CD2 i β1 integryny mogą zastępować LFA-1 w przypadku jego braku. ) (ICAM - intercellular adhesion molecules- należą do rodziny immunoglobulin, ICAM-2, and ICAM-3 również oddziaływuja z LFA-1)

• LFA-2 – LFA-3

• CD28 – B7 ( cząsteczki B7 są homodimerami i należą do nadrodziny immunoglobulin i występują tylko na komórkach zdolnych do stymulacji proliferacji limfocytów T, receptorem dla cząsteczki B7 na powierzchni limfocytów T jest CD28)

• CD2 – LFA-3

Rysunek 3. Połączenia ligand- receptor komórki efektorowej z docelową

Aby doszło do połączenia się komórki efektorowej z docelową niezbędne są również jony Ca2+ i Mg2+ bez których nie dojdzie do interakcji. Do połączenia nie dojdzie również w niskich temperaturach, co jest związane z zahamowaniem oddziaływania LFA-1 oraz ICAM–1, które jest procesem wysoce endoergicznym i wymagającym obecności kationów Ca2+ i Mg2+.

Połączenie komórki efektorowej z docelową nie wystarcza jednak do przeprowadzenia ataku cytotoksycznego. Kolejnym niezbędnym czynnikiem jest dodatkowy, swoisty sygnał aktywacyjny, który jest następnie odbierany przez TCR, receptory komórek NK lub FcγRIII w komórkach K. Prócz tych receptorów do aktywacji limfocytów dochodzi również na skutek interakcji cząsteczek powierzchniowych np.CD8 z cząsteczkami MHC klasy I.

2) Aktywacja komórki docelowej i wydzielanie czynników cytotoksycznych

Po związaniu komórki efektorowej z docelową dochodzi do powstania licznych zmian w strukturze komórek m.in. reorganizacji filamentów aktynowych znajdujących się tuż pod powierzchnią błony komórkowej i jednoczesnego przemieszczenia centrioli co skutkuje maksymalnym zwiększeniem powierzchni styku między komórkami, przesunięciem aparatów Golgiego i ziaren cytoplazmatycznych do bieguna, który sąsiaduje z komórką docelową. Zjawisko to nazwane jest polaryzacją. Proces ten jest kluczowy do przeprowadzenia egzocytozy, czyli ostatecznego efektu cytotoksycznego.

• Rysunek 4. Zjawisko polaryzacji

• Limfocyty wydzielają na drodze egzocytozy do przestrzeni międzykomórkowej czynniki cytotoksyczne znajdujące się we wnętrzu ziaren cytolitycznych, jak również nie związanych z strukturami ziaren. Mechanizm degranulacji nie jest do końca poznany, choć prawdopodobne jest, że proces ten jest analogiczny do wydzielania neurotransmiterów do przestrzeni międzysynaptycznych lub też do reakcji korowej oocytu tuz po wniknięciu plemnika do jego wnętrza. Stymulacja limfocytów Tc do uwolnienia zawartości ziaren jest prawdopodobnie aktywowana pośrednio przez TCR, jak również kluczową rolę w tym procesie odgrywają jony Ca2+. Udowodniono, że działanie inhibitora transferazy rybozylowej ADP powoduje zahamowanie wnikania Ca2+do wnętrza komórki, co skutkuje zablokowaniem degranulacji ziaren cytolitycznych. Natomiast zwiększenie stężenia Ca2+ przez dodanie jonomycyny stymuluje przemieszczenie ziaren, jednak bez wydzielenia ich zawartości. Do pełnego procesu uwolnienia czynników zachodzi po zadziałaniu dodatkowego czynnika aktywującego np. estru forbolu. Ostateczny efekt cytotoksyczny jest konsekwencją działania kilku sygnałów aktywujących, bowiem aktywacja komórki za pośrednictwem kompleksu TCR/CD3 jak również CD2 lub CD7 powodują wzrost wewnątrzkomórkowego stężenia Ca2+.

Działanie czynników na komórkę docelową określane jest terminem zadania „ śmiertelnego ciosu” jako, że związki te są w stanie bezpośrednio niszczyć i zabijać.

3)Recyrkulacja limfocytów Tc

Limfocyty Tc, które uwolniły do przestrzeni międzykomórkowej zawartość ziaren, zadając „śmiertelny cios”, odłączają się od komórki docelowej w celu zaatakowania kolejnej komórki. Konieczny jest pewien odstęp czasowy pomiędzy zaatakowaniem kolejnych ofiar zwany okresem refrakcji, który jest niezbędny do odtworzenia ziaren i produkcji nowych czynników cytotoksycznych.

Czynniki cytotoksyczne ziązane z ziarnami cytolitycznymi limfocytów Tc

Czynniki te zlokalizowane są w specjalnych przestrzeniach błonowych, które zostały utworzone przez aparat Golgiego. Mają cechy pęcherzyków wydzielniczych, jak również lizosomów. Ziarna otoczono są pojedynczą błoną cytoplazmatyczną. Wewnątrz ziarna widoczne jest mocno zagęszczone skupisko czynników zwane rdzeniem, jak również liczne, mniejsze pęcherzyki znajdujące się w części korowej ziarna. Wnętrze pęcherzyków ma kwaśne pH, w ich błonie obecne są receptory dla mannozo-6-fosforanu i białko błonowe związane z lizosomom (LAMP – lysosome- associated membrane protein), które są typowe dla struktur lizosomalnych. Prócz tych cech charakterystycznych w ziarnach cytolitycznych obecne są również enzymy lizosomalne takie jak: α- glikozydaza, α-L-fukozydaza, arylosulfataza, β-glukuronidaza, β-heksozaminidaza, kwaśna fosfataza oraz katepsyny.

Jednymi z najbardziej znanych czynników cytotoksycznych są perforyna, granzymy, granulizyny, wewnątrzkomórkowe białko limfocytów T ( T cell intracellular antygen-1,p40-TIA-1)

1) Perforyna

Perforyna jest glikoproteiną o masie cząsteczkowej od 68 do 70 kDa, składająca się z 555 aminokwasów, która ma zdolność wnikania w strukturę błony komórek docelowych, gdzie polimeryzuje tworząc transmembranowe kanały. Gen dla perforyny zawiera tylko 3 egzony. Cząsteczka perforyny składa się z 4 domen, gdzie C-koncowa domena zbudowana jest z 124 aminokwasów, a N-końcowa domena z 43 aminokwasów ( obydwie te domeny występują tylko w cząsteczce perforyny). Z kolei środkowa część cząsteczki składa się z dwóch domen, które wykazują 20% homologi do odpowiednich domen w składnikach C6, C7, C8 i C9 dopełniacza. Jedna z nich jest bogata w cysteinę, druga natomiast zawiera sekwencje aminokwasów zdolne do wytworzenia jednego odcinka o strukturze α-helikalnej i dwóch odcinków o strukturze β-harmonijki. Wskazuje to na charakter hydrofobowy tej domeny, która może być odpowiedzialna za wnikanie wewnątrz dwuwarstwy lipidowej. Miejsce wiązania jonów Ca2+, które odgrywają kluczową rolę w mechanizmie działania porfiryny, znajduje się na domenie N-końcowej.

Pory zbudowane z polimerów porfiryny tworzą cylindryczną strukturę hydrofobową o średnicy około16 nm co jest równoznaczne około 20 czasteczkom perforyny. Niewiadomo czy struktura kanału jest najpierw konstruowana , dopiero potem wbudowywane wewnątrz błony czy też rozbudowywana jest już w dwuwarstwie lipidowej. Proces polimeryzacji porfiryny i wbudowanie do blony komórkowej jest ściśle zależny od Ca2+ lub Sr2+ , które powodują zmiany konformacyjne porfiryny, która występuje w ziarnach cytolitycznych w nieaktywnej formie globularnej. Obecność Ca2+ umożliwia przyłączenie monomeru porfiryny do błony komórkowej. W ziarnach cytolitycznych stwierdzono również obecność kalretikuliny, białka wiążącego Ca2+ i posiadającego C-koncową domenę KDEL, która zapewnia pozostawanie w świetle aparatu Golgiego. Kalretikulina odpowiada prawdopodobnie za wiązanie Ca2+ co uniemożliwia polimeryzację porfiryny wewnątrz ziaren i tworzenie kanałów w ich błonach, jak również może pełnic fukcje opiekunczą, ponieważ globularna forma jest mniej poddatna na uszkodzenia. PO wydzieleniu porfiryny do przestrzeni międzybłonowej kalretikulina pozostaje związana z porfiryną pomagając jej w perforacji błony. Związanie perforyny z bloną zachodzi prawdopodobnie przez fosfolipidy błonowy – fosfatydylocholinę – która ma zdolność wiązania Ca2+ co powoduje wzrost powinowactwa perforyny do fosfatydylocholiny. Jak wykazano jony Ca2+ mogą również powodować zahamowanie polimeryzacji porfiryny lub też czopowania utworzonych kanałów transmembranowych co ma miejsce w warunkach niskiego pH i wysokiego stężenia Ca2+ i Zn2+ .Innymi inhibitorami porfiryny są również niektóre lipoproteidy i białka S osocza krwi, które konkurując z perforyną o przyłączenie do błony uniemożliwiają tworzenie porów.

Inną możliwością związania perforyny z błoną jest współudział niektórych receptorów błonowych lub tez tak jak w przypadku komórek NK, które wydzielają czynnik aktywujący płytki PAF, który po związaniu z perforyną umozliwia jej interakcje z receptorem PAF znajdującym się w błonie.

Powstałe pory umożliwiają gwałtowne wnikanie wody, soli, a nawet biopolimerów do wnętrza komórki , jak również wydzielanie na ekstraktu wewnątrzkomórkowego. Skutkiem zaistniałych zmian jest zniszczenie integralności błony, nieprawidłowo funkcjonująca gospodarka mineralna i w efekcie pęknięcie komórki.

• Na skutek wniknięcia do wewnątrz komórki dużej ilości Ca2+ aktywowane są liczne endonukleazy, które degradują DNA kierując komórkę docelową na drogę apoptozy.

Gen na perforyne ulega ekspresji głownie w komórkach ( słaba ekspresja zachodzi w komórkach makrofagów, astrocytach, stymulowanych komórkach macierzystych szpiku) . Działanie niektórych cytokin tj. IL-2, IL-4, IL-7 IL-12, G-CSF jak również pektyny, jonofory wapniowe stymulują ekspresję tego genu. Z kolei hamowanie ekspresji tego genu jest obserwowane w wyniku działania TGF- β

2) Granzymy (Fragmentyny)

Granzymy ( granule-associated enzymes) są proteazami serynowymi, które wystepują tylko w ziarnach cytolitycznych . Ich druga nazwa – fragmentyny- pochodzi od posiadanej zdolności do fragmentowania DNA komórki docelowej. Do tej pory wyróżniono ok. 12 różnych granzymów występujących u gryzoni i u ludzi.

• Granzym	Występowanie	Masa cząsteczkowa [kDa]	Glikozylacja	Aktywność enzymatyczna	Miejsce cięcia
  A*	Cz, M, Sz	60 (dimer)	+	tryptaza	Arg/Lys
  B*	Cz, M, Sz	27-32	-	Asp-aza	Asp/Glu
  C	M, Sz	27	+	?	Asn/Ser
  D	M	35-50	+	?	Phe/Leu
  E	M	35-45	+	?	Phe/Leu
  F	M, Sz	35-40	+	?	Phe/Leu
  G	M	30	+/-	?	Phe/Leu
  H	Cz	30	?	chymaza	Phe/Leu
  I	Sz	30	?	?	?
  J	Sz	30	?	?	?
  K*	Cz, Sz	28	?	tryptaza	?
  M (Met-aza 1)	Cz, Sz	30	+/-	Met-aza	Met/Leu

Tabela 1. Granzymy i ich właściwości

Skróty zastosowane w tabeli: Cz- człowiek, M- mysz, Sz - szczur * U człowieka granzymy A, B i K mają odpowiednio nazwę granzymy 1, 2 i 3

Wykazano, że geny kodujące granzymy charakteryzuja się dużym stopniem homologii z genami innych proteaz serynowych tj. chymazy, elastazy, trypsyny, tryptazy.

• Granzymy biorą czynny udział w procesie cytotoksycznym bezpośrednio działając na DNA , jak również prawdopodobnie aktywują perforynę i inne czynniki cytotoksyczne. Po wniknięciu granzymów do wnętrza komórki docelowej przez pory utworzone przez perforynę przekierowuja komórkę na drogę apoptozy na skutek wykazywania właściwości proteolitycznych. Dla przykładu granzym B tnie niektóre proenzymy z rodziny kaspaz, które w wyniku modyfikacji przekształcają się w aktywne cząsteczki (np. kaspaza 3) biorące bezpośredni udział w stymulacji i przebiegu apoptozy. Prócz tego, granzym B w wyniku cięcia proteolitycznego aktywuje białko Bid, które należy do białek z rodziny Bcl-2 wykazujących właściwości proapoptotyczne (inicjacja szlaku apoptotycznego związanego z mitochondriami). Jedynie granzym B wykazuje zdolnośc do aktywacji kaspaz. Inne graznymy wiążą białka chromatyny powodując ich cięcie, dzięki czemu ułatwiony jest dostęp do DNA dla endonukleaz.Jednym z takich białek jest granzym A, który wiąże się z histonami i białkami macierzy jądrowej ( m.in. nukleiną bogatą w lizynę) a następnie degraduje te białka. Wykazano również, że granzymy niszczą białka cytoplazmatyczne i organelle komórkowe. Prócz podstawowych funkcji w efekcie cytotoksycznym, granzymy biora udział w lokalnych procesach zapalnych hydrolizując składniki macierzy pozakomórkowej tj. kolagen typu IV i proteoglikany. Granzym A wykazuje zdolność stymulacji proliferacji limfocytów B, z kolei granzym B ma właściwości antyproliferacyjne względem komórek nowotworowych.

3)Wewnątrzkomórkowe białko limfocytów T p40-ITA-1

Białko p40-ITA-1 o masie 40 kDa obecne jest w błonie ziaren cytolitycznych i składa się z trzech domen wykazujących zdolność do wiązania RNA. Prawdopodobnie białko to jest odpowiedzialne za degradację RNA komórki docelowej, które wnika do wnętrza przez kanały perforynowe. Wykazano rowneiz obecność w ziarnach cytolitycznych innego białka o masie ok. 15kDa, które było wiązane przez przeciwciała przeciwko p40-ITA-1 , które nazwano GMP-17 ( granule membrane protein 17). Wykazuje on duży stopień homologi do niektórych kanałów wapniowych bramkowanych napięciem tak więc możliwe jest, że jest ono odpowiedzialne za regulację kanałów wapniowych podczas reakcji cytolitycznej.

4)Granulizyna

Granulizyna jest białkiem należącym do rodziny sapozyn, które wykazują zdolność wiązania lipidów. Ekspresja genu na granulizyne daje dwa główne produkty białkowe o masie 15kDa i 9kDa. Białka te są odpowiedzialne za przeprowadzenie lizy błony komórkowej bakterii gramdodatnich i gramujemnych, pierwotniaków i innych drobnoustrojów. Granulizyna jest również zdolna do degradacji błon mitochondrialnych i aktywacji kaspazy 9 prowadząc do indukcji apoptozy.

Jak komórka zabezpiecza się przed działaniem własnych czynników cytotoksycznych?

Mechanizm ochronny komórek efektorowych nie jest jeszcze dokładnie poznany. Prawdopodobne jest, że obecne w ziarnach glikozaminoglikany ( np. siarczan chondroityny A) neutralizuje i transportuje cząsteczki perforyny i granzymów, pełniąc funkcje ochronne limfocytów. Prócz tych zabezpieczeń w błonie limfocytów znajdują się białka o właściwościach zbliżonych do HRF ( czynnik restrykcji homologicznej – ma zdolność do wiązania składników C8 i C9 układu dopełniacza) , które wiążą wolną perforynę uniemożliwiają zniszczenie komórki eżektorowej.

• Zabezpieczenie przed efektem cytolitycznym może również się odbywać na etapie hamowania indukcji szlaku apoptotycznego. Tak więc aktywność granzymów może być regulowana przez serpiny np. wirusowe białko CrmA, które hamując aktywność kaspaz uniemożliwiają indukcje apoptozy. W komórkach ssaków do tej pory zidentyfikowano 10 serpin, z których najlepiej poznaną jest PI-9, która hamuje aktywność granzymu B. PI-9 występuje w cytozolu limfocytów Tc i komórkach NK chroniąc je przed własnymi granzymami.

REAKCJA CYTOTOKSYCZNA ZALEŻNA OD RECEPTORÓW DLA CZĄSTECZEK NADRODZINY TNF

Reakcja cytotoksyczna zależna od receptorów dla cząsteczek rodziny TNF polega na oddziaływaniu ligandów produkowanych przez komórki efektorowe, dla receptory znajdują się na komórkach docelowych. Po związaniu ligandu z receptorem generowany jest sygnał indukujący w komórce docelowej szlak apoptotyczny. Następnie limfocyt oddziela się i ulega recyrkulacji podobnie jak w przypadku mechanizmu zależnego od ziaren cytolitycznych. Istnieje również wydzielanie cytotoksycznych ligandów przez limfocyty Tc które wiążą się z receptorami na powierzchni komórek docelowych, wówczas związanie komórki eżektorowej do ofiary nie jest konieczne ( tu efekt cytotoksyczny nie jest swoisty)

• Wyżej omawiane ligandy należą do nadrodziny TNF, których receptory są zlokalizowane w błonie Komorek docelowych. Część cytoplazmatyczna tych receptorów zawiera tzw „domenę śmierci”. Do cząsteczek tych naeżą: Apo-1L/FasL (CD95L), TRAIL, TNF, LT-α. Cząsteczki te w wyniku związania z receptorami na komórce docelowej pobudzają zależne od „domeny śmierci” mechanizmy komórkowe zmierzające do stymulacji kaspaz i w konsekwencji indukcji apoptozy.

Ryc 19.6

Czynnikiem odgrywającą kluczową rolę w procesie cytolitycznym zależnym od receptorów dla cząsteczek rodziny TNF u limfocytów jest FasL, który łączy się z receptorem Fas. Receptor ten jest uniwersalny dla wielu typów komórek. Głównie limfocyty Tc CD4+ działają za pomocą FasL, limfocyty Tc CD8+ wykorzystują mechanizm zależny od FasL w dużo mniejszym stopniu.

Efekt cytolitycznym zależny od receptorów dla cząsteczek rodziny TNF w głównej mierze zależy od ekspresji liganda przez komórkę efektorową , jak również syntezę odpowiednich receptorów na powierzchni komórki docelowej. Pobudzenie ekspresji FasL zachodzi za pośrednictwem TCR wspomaganym przez niektóre cytokiny tj. IL-2, IL-12, IFN-γ, natomiast ekspresja Fas jest stymulowana przez IFN-γ i TNF

• Rysunek 2. Mechaniznm cytotoksyczny zależny od receptorów z rodziny TNF

Inne mechanizmy

Istotnym czynnikiem wydzielanym przez aktywowane limfocyty Tc , który nie powoduje bezpośrednio efektu cytolitycznego, ale go reguluje jest leukoregulina. Białko to o masie 50kDa zwiększa wrażliwość komórek docelowych na działanie czynników cytotoksycznych, jak również leków cytostatycznych.

• Wykazano również, że niektóre metabolity np. ATP uwalniane przez limfocyty mogą indukować szlak apoptotyczny w docelowych komórkach nowotworowych i tymocytach. Działanie ATP zachodzi za pośrednictwem receptorow purynergicznych P2z, które tworzą bardzo duże kanały transmembranowe w obecności ATP. Skutkuje to zaburzeniem gospodarki mineralnej, szokiem tonicznym i umożliwieniem wniknięcia innych czynnikow cytotoksycznych.