Articles wiki

• PML - białko, które chroni przed nowotworami

  Agata Bagińska

  Ciałka jądrowe PML i wchodzące w ich skład białko PML spełniają różnorodne role w organizmie. Odpowiedzialne są m.in. za regulację genów, supresję nowotworową, proteolizę, apoptozę, naprawę DNA, starzenie komórkowe. W poniższym artykule przybliżono najważniejsze funkcje ciałek jądrowych PML i ich głównego składnika.

1. Wstęp

Białko PML (promyelocytic leukaemia protein) jest składnikiem multibiałkowego kompleksu, zwanego ciałkami jądrowymi PML. Po raz pierwszy odkryto go u pacjentów cierpiących na ostrą białaczkę promielocytową (APL - acute promyelocytic leukaemia). Rola PML i PML NB w aktywności jądrowej nie jest całkowicie poznana; wiadomo jednak, że są one zaangażowane w regulację transkrypcji, apoptozę, supresję fenotypu nowotworowego, starzenie komórkowe oraz wiele innych procesów. (Rysunek 1)

2. Budowa białka PML i ciałek jądrowych PML

Locus genu PML obejmuje w przybliżeniu 35 kb i jest podzielony na dziewięć exonów. Dzięki wielu transkryptom PML otrzymanym przez alternatywny splicing, białka PML mają masę cząsteczkową od 48 – 97 kDa. Wszystkie izoformy PML mają jednakowy region N-końcowy, natomiast różnice wykazują w regionie środkowym lub C-terminalnym. Białko to zawiera trzy domeny wiążące cynk bogate w cysteinę: palec RING, dwie domeny B box (B1 i B2) oraz domenę skręconą α helikalnie, odpowiednio ułożone od N- do C- końca, które razem tworzą motyw RBCC/TRIM i odpowiadają za jego funkcje.[4] (Rysunek 2)

Gen PML jest zaangażowany w translokację chromosomową t(15;17), w wyniku której następuje fuzja PML, znajdującego się na chromosomie 15 i receptora kwasu retinowego (RARα - retinoic acid receptor α), umieszczonego na chromosomie 17. Ekspresja białka PML - RARα jest wystarczająca do transformacji w komórkach APL i rozwoju białaczki. Podczas wybuchów APL PML - RARα powoduje delokalizację PML, w wyniku czego następuje rozerwanie PML NB. PML - RARα powoduje białaczkę APL, podczas gdy negatywne dominujące mutanty RARα nie przyczyniają się do jej powstawania, ujawniając możliwości onkogenne białka PML - RARα i podkreślając ważność degradacji PML NB w leukemogenezie.[6]

PML NBs, zwane także domenami onkogennymi PML (PODS – PML oncogenic domains), domenami jądrowymi 10 (ND10) czy ciałkami Kremer’a (Kr) są strukturami makrocząsteczkowymi w kształcie precli. Ich rozmiar wynosi w przybliżeniu 0,2 – 1,0 μm. W typowej komórce znajduje się zwykle 10 – 30 tych struktur, chociaż ich liczba i rozmiar zmieniają się w czasie cyklu komórkowego, a także są zależne od typu komórek. Istnieje wiele izoform PML, z których większość jest związana z PML NB i matrix jądrową. Jednak niektóre izoformy gromadzą się we frakcjach cytozolu. Chociaż PML jest jedynym niezbędnym białkiem wymaganym do tworzenia ciałek PML, ponad trzydzieści innych białek, takich jak: Sp100, SUMO1, HAUSP, DAXX, Isg20 czy CBP lokalizuje się w tych strukturach. Mogą one oddziaływać na strukturę i funkcję PML NB. Wśród nich są takie, które fizycznie oddziałują z PML, należą do nich: p53, pRb, DAXX, CBP i eIF4E.[2,4,6]

3. Funkcje PML i PML-NB

Motyw RBCC/TRIM uczestniczy w oddziaływaniach białko – białko i jest odpowiedzialny za multimeryzację PML, lokalizację PML w ciałkach jądrowych oraz heterodimeryzację z PML - RARα, jednak nie nadaje zdolności wiązania DNA. Modyfikacja PML przez ubikwitynopodobne białko SUMO1 jest konieczna do właściwego tworzenia ciałek jądrowych. Mutanty, u których nie może zajść SUMOylacja PML nie są zdolne do poprawnego tworzenia PML NB. Białko to odgrywa ważną rolę w tworzeniu i stabilności PML NB, a także może regulować funkcje wielu białek od niego zależnych.[2,5,6]

Palec RING znajduje się w wielu funkcjonalnie różnych białkach od roślin po człowieka. Mutacje tych konserwatywnych ligandów wiążących atomy cynku zakłócają formowanie PML NB in vivo. Ponadto mutacje te są skorelowane z utratą aktywności supresorowej transformacji nowotworowej, apoptotycznej i antywirusowej.[4]

Motyw RBCC/TRIM zawiera również dwa motywy B box (B1 i B2) graniczące z domeną RING. Zarówno B1, jak i B2 osiągają małe rozmiary (odpowiednio: 42 i 46 reszt). Powierzchnia hydrofobowa B box jest wykorzystywana do dimeryzacji heterogennych box lub heterogennych interakcji białek. Druga powierzchnia zawiera miejsce wiążące cynk. Podstawienie konserwatywnych ligandów cynkowych B1 i/lub B2 innymi zakłóca tworzenie PML NB in vivo, ale nie zapobiega oligomeryzacji PML – PML. Działając wspólnie RING i B box wpływają na funkcję PML jako supresora wzrostu.[4]

Struktury skręcone α helikalnie uczestniczą w oddziaływaniach homo- i heterodimerycznych oraz w multimerycznych, np. trimerycznych, heksamerycznych. Struktury te obejmują reszty 229 – 323. Są one konieczne w procesie multimeryzacji PML, jak również w heterodimeryzacji z PML - RARα. Obecność tego regionu jest także wymagana do tworzenia ciałek jądrowych i aktywności supresora wzrostu in vivo.[4]

Podsumowując, motyw RBCC/TRIM w PML jest niezbędny w procesie tworzenia PML NB in vivo, jak również aktywności supresorowej wzrostu, apoptotycznej i antywirusowej. Te i inne funkcje PML wydają się być zależne od homo- i heterogennych oddziaływań białko – białko za pośrednictwem motywu RBCC/TRIM.[4]

3.1 PML a kontrola apoptozy

PML jest niezbędny w procesie apoptozy aktywowanej wieloma stresami czy uszkodzeniami DNA. Ta proapoptotyczna aktywność może być antagonizowana przez białko fuzyjne PML - RARα. Niewątpliwy dowód ważności PML w indukcji apoptozy przedstawiono w badaniach nad myszami nokautowanymi PML, które są oporne na letalne działanie promieniowania γ oraz CD95. Komórki PML - / - nie są wrażliwe na apoptozę indukowaną zarówno CD95 i promieniowaniem γ, jak i ceramidami, TNF (Tumor Necrosis Factor) i IFN (interferon). PML - RARα może negatywnie oddziaływać na funkcje PML, a inaktywacja aktywności proapoptotycznej PML przez fuzję białek może być decydującym krokiem w leukemogenezie APL.[6,10]

Udział PML w apoptozie zależnej od p53

Gen p53 należy zaliczyć do grupy genów supresorowych. Przeważająca część nowotworów u ludzi cechuje się jego mutacjami. U człowieka zlokalizowany jest w krótkim ramieniu chromosomu 17. Jego utrata często wiąże się z różnymi typami nowotworów ludzkich, np.: rak sutka, płuc, jelita grubego, astrocytoma i APL. Białko p53 jest fosfoproteiną występującą w jądrze komórkowym. Uczestniczy w regulacji proliferacji komórkowej, chociaż jego funkcje biochemiczne nie są do końca poznane. Jego struktura sugeruje, że być może bierze udział w regulacji transkrypcji. Dziki gen p53 znosi transformację nowotworową wywołaną transfekcją onkogenami ras i myc. Gen p53 kontroluje ekspresję genów hamujących proliferację komórkową.[3,6,8]

Fakt, że myszy nokautowane PML (PML - / -) są oporne na letalne skutki promieniowania γ, wskazuje, że PML i PML NB są zaangażowane w apoptozę i zatrzymanie cyklu komórkowego w odpowiedzi na uszkodzenia DNA. Gen supresorowy p53 odgrywa kluczową rolę w tym procesie. Tymocyty p53 - / - są całkowicie oporne na apoptozę indukowaną promieniowaniem γ, wskazując tym samym, że p53 jest absolutnie konieczny w procesie apoptozy wywołanej uszkodzeniami DNA. Ochrona przed apoptozą w tymocytach PML - / - koreluje z osłabioną indukcją docelowych genów p53, takich jak: proapoptotyczny BAX i inhibitor cyklu komórkowego p21. PML bezpośrednio oddziałuje z domeną p53 wiążącą DNA, lokalizuje się wspólnie z p53 w ciałkach jądrowych PML i działa jako koaktywator transkrypcji p53.[2,6]

W przypadku działania promieniowania γ p53 jest aktywowany na różne sposoby. Jednym z takich mechanizmów jest acetylacja, która zwiększa zdolność wiązania DNA i aktywuje transkrypcję. W komórkach PML - / - acetylacja p53 jest znacznie osłabiona. Chociaż PML nie posiada aktywności wewnętrznej acetylotransferazy, bezpośrednio oddziałuje z acetylotransferazą CBP i lokalizuje się w ciałkach Kremer'a wspólnie z CBP/p300 i p53. Zdolność PML do aktywacji transkrypcji p53 jest zależna od PML NB, stąd mutanty PML, które nie mogą być umieszczone w PML-NB, ale wciąż oddziałują z p53 i CBP nie są zdolne do koaktywacji transkrypcji p53. (Rysunek 3) Co więcej, tylko specyficzna izoforma PML może modulować transkrypcję p53. W ten sposób PML, przynajmniej częściowo dzięki ciałkom jądrowym, moduluje funkcje p53, co z kolei zwiększa skuteczność jego aktywności supresji nowotworowej.[6]

Ścieżki proapoptotyczne niezależne od p53

Fakt, że PML jest konieczny do zajścia apoptozy indukowanej FAS i TNFα wskazuje, że PML moduluje również ścieżki proapoptotyczne niezależne od p53, np. wywołane kompleksem sygnalizacyjnym indukującym śmierć (DISC) w błonie plazmatycznej. DAXX bierze udział w transdukcji sygnału FAS/TNF z błony plazmatycznej do PML NB. DAXX został pierwotnie sklonowany jako białko oddziałujące z FAS i jest mediatorem apoptozy indukowanej FAS i TGFβ. Bezpośrednio oddziałuje z PML i PML - RARα. W nieobecności PML DAXX jest delokalizowany z PML NB i gromadzony w jądrowych regionach gęstej chromatyny. Ponadto w komórkach PML - / - zdolność DAXX do wywołania apoptozy i zwiększenia sygnałow proapoptotycznych FAS jest znacznie osłabiona. DAXX tłumi transkrypcję, a jego sekwestracja w ciałkach jądrowych PML blokuje tę aktywność. Przeciwnie, ekspresja PML - RARα przynosi w rezultacie delokalizację DAXX z PML NB, co z kolei wzmacnia represję transkrypcji DAXX.[6]

3.2 Rola PML w starzeniu komórkowym

Ekspresja PML i innych składników ciałek jądrowych jest wyraźnie indukowana przez interferon typu I i II. W konsekwencji następuje wzrost liczby i rozmiarów PML NB w jądrze. Sugeruje to, że PML i PML NB mogą uczestniczyć w funkcjach komórkowych regulowanych przez IFN, takich jak supresja wzrostu i transformacji nowotworowej. PML działa jak silny supresor wzrostu przez blokowanie fazy G1 cyklu komórkowego. Wiadomo, że mysie embrionalne fibroblasty (MEFs)nokautowane PML rosną znacznie szybciej niż komórki typu dzikiego. Poza tym MEFs mające tylko jeden allel PML aktywny wykazują pośrednie tempo proliferacji, sugerując, że haploidalne PML może nie być wystarczające do supresji wzrostu. Populacja MEFs PML - / - w fazie S cyklu komórkowego jest zwiększona i jednocześnie ulega zmniejszeniu w fazie G0/G1. Zwiększone tempo proliferacji jest także obserwowane w splenocytach, tymocytach i keratynocytach PML - / -. Te dane wskazują, że PML może funkcjonować in vivo jako negatywny regulator wzrostu.[6,7]

Ostatnie doniesienia potwierdzają udział PML w indukcji zatrzymania wzrostu i starzenia komórkowego przy transformacji nowotworowej. Onkogenne RAS (RASval12) wywołuje starzenie komórkowe indukowane ekspresją kilku supresorów nowotworowych, np. p53, inhibitor CDK p16INK4a. RAS reguluje również PML. Ponadto powoduje gromadzenie p53 w ciałkach jądrowych i indukuje jego acetylację i aktywację transkrypcji. (Rysunek 4) PML, p53 i CBP tworzą in vivo kompleks indukowany RAS. W komórkach PML - / - starzenie indukowane RASval12 jest drastycznie osłabione. Dowodzi to niezbędnego zaangażowania PML i p53 w starzenie komórkowe przy transformacji nowotworowej. Jednak indukcja p53 zależna od RAS nie jest zasadniczo zmniejszona w MEFs PML - / -, wskazując, że PML jest wymagany do aktywności transkrypcji p53, ale nie do jego stabilności i ekspresji. RASval12 indukuje ekspresję PML, która z kolei umożliwia acetylację i aktywację transkrypcji p53, w wyniku której następuje aktywacja p21 i zatrzymanie wzrostu. Zdolność RAS do indukcji p53 jako docelowego genu dla p21 jest osłabiona w komórkach PML - / -.[6]

3.3 PML a supresja transformacji nowotworowej

Myszy PML - / - są wysoce podatne na rozwój choroby nowotworowej, co dowodzi aktywności supresorowej transformacji nowotworowej PML. PML - RARα może powodować dezintegrację i rozerwanie PML NB i nieprawidłowo rozmieszczać PML i inne składniki ciałek Kremer'a w jądrze komórkowym. W ten sposób inaktywacja funkcji supresora nowotworowego PML na drodze fuzji białek może stanowić decydujący krok w powstawaniu białaczki. Ponadto następuje redukcja do hemizygoty w wyniku translokacji chromosomowej t(15;17), która ma miejsce w przypadku APL. To z kolei umożliwia negatywne dominujące działanie białka fuzyjnego PML - RARα. Hipoteza ta została potwierdzona na podstawie badań, w których krzyżowano transgeniczne myszy PML - RARα z myszami PML - / -. Inaktywacja PML dała w rezultacie dramatyczny wzrost zapadalności na leukemię i przyspieszenie początku choroby. Leukemogeneza była też wyraźnie wzmożona u myszy PML + / -, wykazując, że haploidalne PML nie jest wystarczającym antagonistą PML - RARα zaangażowanego w rozwój białaczki.[5,6]

PML fizycznie oddziałuje z supresorem nowotworowym retinoblastoma (Rb) także występującym w PML NB, który kontroluje początek cyklu komórkowego i starzenie komórkowe. PML może asocjować w PML NB z kompleksem makrocząsteczkowym zawierającym korepresory: N-CoR/SORT, mSin3, Ski/Sno oraz deacetylazy histonowe (HDAC1). (Rysunek 5) Kompleks ten jest niezbędny do represji transkrypcji za pośrednictwem supresorów nowotworowych MAD i Rb. Jak już wiadomo PML zwiększa efektywność represji transkrypcji pRb, podczas gdy PML - RARα jest jego antagonistą. PML wzmacnia funkcje transkrypcji supresorów nowotworowych i supresorów wzrostu. Jednak funkcje te mogą wydostać się spod kontroli w wyniku negatywnego dominującego działania PML - RARα nad PML.[6]

3.4 Udział PML w stabilności genomowej

Białaczka u transgenicznych myszy PML - RARα rozwija się po długiej latencji, co sugeruje, że muszą nastąpić dodatkowe procesy genetyczne i kooperować z fuzją i ekspresją PML - RARα w leukemogenezie. Inaktywacja PML zwiększa zachorowalność i przyspiesza początek białaczki dzięki akumulacji kolejnych procesów genetycznych. Białka, takie jak: BLM, nibrin/p95, Mre11 i topoizomeraza IIIα są zaangażowane w utrzymanie stabilności genomowej i gromadzą się w PML NB. PML może oddziaływać na ich funkcje regulując ich lokalizację w ciałkach jądrowych PML. W komórkach PML - / -, jak również w wybuchach APL, następuje delokalizacja BLM. Ponadto w MEFs PML - / - częstotliwość zmienionych chromatyd siostrzanych (SCE) - charakterystyczna cecha niestabilności genomowej komórek Bloom’a - jest znacznie zwiększona, co sugeruje, że obecność BLM w PML NB jest niezbędna do prawidłowego funkcjonowania i stabilności genetycznej.[6,9]

3.5 Udział ciałek jądrowych PML w naprawie DNA

PML NB są wysoce dynamicznymi strukturami, które ulegają rozerwaniu albo zmieniają morfologię w odpowiedzi na stres komórkowy, np. szok cieplny, ekspozycja na metale ciężkie oraz uszkodzenia DNA. PML NB łączą się prawdopodobnie z miejscami uszkodzeń DNA powstałymi wskutek działania promieniowania jonizującego (IR). Rola PML NB w naprawie DNA odbywa się na kilka sposobów: niehomologicznej rekombinacji, homologicznej rekombinacji oraz alternatywnego wydłużania telomerów. Translokacja niektórych czynników naprawczych (np. Atr, Mre11, NBS1, BLM) do i z PML NB jest regulowana w odpowiedzi na uszkodzenia DNA. Liczne czynniki naprawcze DNA lokalizują się w PML NB w czasowo regulowany sposób przed i po wystąpieniu uszkodzeń. Poza tym myszy nokautowane PML (PML - / -) wykazują zwiększoną zapadalność na nowotwory w odpowiedzi na karcynogeny, a komórki pobrane z tych zwierząt są oporne na promieniowanie IR i mają podwyższony poziom zmienionych siostrzanych chromatyd (SCE).[2,6]

PML NB zaangażowane są w mechanizm utrzymania telomerów, znany jako alternatywne wydłużanie telomerów (ALT), który występuje w liniach komórek negatywnych telomeraz. Podzespoły PML NB w liniach komórkowych ALT lokalizują się wspólnie z telomerycznym DNA, białkami wiążącymi telomery Trf1 i Trf2 oraz niektórymi białkami zaangażowanymi w naprawę DNA i rekombinację homologiczną, np.: Brca1, NBS1, Rad1/Rad9/Hus1, Rad17, RPA1, Rad51 i Rad52. Podzespoły te znane są jako ciałka PML związane z ALT (APBs). Pojawienie się APBs koreluje ze stabilizacją długości telomerów w liniach komórkowych ALT, sugerując, że te ciałka są odpowiedzialne za utrzymanie długości telomerów w przypadku braku aktywności telomerazy.

Ciałka jądrowe PML także lokalizują się wspólnie z białkiem BLM w miejscach naprawy z wycinaniem nukleotydów (NER) w komórkach traktowanych promieniowaniem UV C, dostarczając tym samym dowodów na udział PML NB w procesie NER, jak również w naprawie pęknięć podwójnej nici DNA spowodowanych promieniowaniem IR. PML NB także lokalizują się i asocjują in vivo z białkiem odpowiedzi na uszkodzenia DNA - TopBP1 również w wyniku działania promieniowania IR. W przeciwieństwie do NBS – Mre11 TopBP1 tworzy wewnątrzjądrowe ogniska, które nie lokalizują się wspólnie z PML NB w komórkach zanim nastąpi traktowanie ich IR. Ogniska te pojawiają się w ciągu godziny od zadziałania promieniowania, a po ośmiu godzinach zawierają one inne czynniki, takie jak: Rad50, Rad9, Atm, Brca1 i BLM.

4. Podsumowanie

Gen PML, podobnie jak wiele onkogenów, jest zdolny do translokacji chromosomowej. Dlatego, gdy został odkryty,naukowcy zaliczyli go do tej grupy genów. Jednak późniejsze badania dowiodły, że PML odgrywa ważną rolę w supresji nowotworowej poprzez indukcję apoptozy, zatrzymanie wzrostu komórek oraz starzenie komórkowe. Natomiast myszy PML - / - mają osłabioną odporność, wykazują niestabilność chromosomów i są wrażliwe na kancerogenezę. Ponadto PML NB są zaangażowane w regulację transkrypcji oraz odpowiedź antywirusową, choć mechanizm tego ostatniego procesu nie jest jeszcze poznany. Prezentują miejsca tworzenia się wielu kompleksów i modyfikacji potranslacyjnych czynników regulatorowych. Analizując różne funkcje PML i ciałek jądrowych stwierdzono, że gen ten należy do grupy antyonkogenów i wspiera nas w walce z nowotworami.

Literatura

1. Brown Bron. T. A.; Genomy; Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2001

2. Dellaire Graham, Bazett – Jones David P.; PML nuclear bodies: dynamic sensors of DNA damage and cellular stress; BioEssays 26.9, 2004, 963 – 977

3. Fogal V., Gostissa M., Sandy P., Zacchi P., Sternsdorf T., Jensen K., Pandolfi P. P., Will H., Schneider C., Del Sal G.; Regulation of p53 activity in nuclear bodies by a specyfic PML isoform; EMBO J. 6, 2000, 185 – 195
4. Jensen Kirsten, Shiels Carol, Freemont Paul S.; PML protein isoforms and the RBCC/TRIM motif; Oncogene (2001) 20, 7223 – 7233
5. Rego E., Wang Z. G., Peruzzi D., He L. Z., Cordon-Cardo C., Pandolfi P. P.; Role of promyelocytic leukemia (PML) protein in tumor suppression; J. Exp. Med. 23, 2001, 521 – 529
6. Salomoni Paolo, Pandolfi Pier Paolo; The Role of PML in Tumor Suppression; Cell, January 25, 2002, vol. 108, 165 - 170
7. Wang Z. G., Delva L., Gaboli M., Rivi R., Giorgio M., et al.; Role of PML in cell growth and the retinoic acid pathway; Science 279, 1998, 1547 - 1551
8. Węgleński Piotr; Genetyka Molekularna; Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2000
9. Zhong S., Hu P., Ye T. Z., Stan R., Ellis N. A., et al.; A role for PML and the nuclear body in genomic stability; Oncogene 18, 1999, 7941 – 7947
10. Zhong Z. G., Ruggero D., Ronchetti S., Zhong S., Gaboli M., Rivi R., Pandolfi P. P.; PML is essential for multiple apoptotic pathways; Nat. Genet. 20, 1998, 266 – 272

11. http://www.benbest.com/health/cancer.html

---