PCR wczoraj

Wprowadzenie

Porównanie PCR-u w tytule niniejszego artykułu do piosenki nie jest, jak mogłoby się wydawać, nieuzasadnione. Otóż od jakiegoś czasu w muzycznym showbusinessie panuje moda na „odgrzewanie starych kawałków”, hitów które w swoim czasie, powiedzmy w latach osiemdziesiątych, królowały na wszystkich ówczesnych listach przebojów i parkietach całego świata. Nowsze wersje różnią się od swoich pierwowzorów tylko i wyłącznie w pewnych detalach i tak na przykład w oryginale śpiewa mężczyzna natomiast w nowoczesnej przeróbce da się usłyszeć kobiecy głos odpowiednio „podrasowany” elektronicznymi wstawkami. Otóż sprawa podobnie ma się z PCR-em. Co rusz powstają to nowsze, lepsze wersje starego dobrego PCR-u, hitu z 83 roku, do którego „tańczyły i tańczą” od przeszło 20 lat wszystkie laboratoria biochemiczne na całym świecie. Różnica pomiędzy „ulepszoną” piosenką, a nowszą wersją reakcji PCR jest taka, iż o ile wartość artystyczna danego utworu pozostaje kwestią gustu indywidualnego słuchacza, o tyle nawet drobne, wydawać by się mogło detale wprowadzone w „linię melodyczną” „starego” PCR-u, mogą odbić się szerokim echem w świecie nauki...

Historia

Powszechnie wiadomo, że polimerazową reakcję łańcuchową wymyślił Kary Mullis (dżentelmen na zdjęciu zamieszczonym poniżej)... a jednak nie do końca. Otóż po raz pierwszy enzymatyczne namnażanie krótkich fragmentów oligonukleotydowych opisał i potwierdził doświadczalnie Kleppe i współpracownicy na łamach pisma „Journal Of Molecular Biotechnology” już w 1971 r.!, czyli dwanaście lat przed Mullisem. Jednak pomysł ten nie zyskał miana rewolucyjnego i całość „rozeszła się po kościach”. Być może mieli kiepskiego agenta... Dopiero kiedy w 1983 r. jadący na urlop Mullis w trakcie jazdy wpadł na to, iż reakcję polimeryzacji DNA można przeprowadzić in vitro, namnażając dowolnie wybrany fragment genomu, do niemal niebotycznej ilości powtórzeń w świecie naukowym zahuczało, a sam wynalazca stał się biochemicznym „bożyszczem tłumów”. O dziwo jego praca została odrzucona przez redakcję Nature, na czym nie omieszkał skorzystać jego odwieczny amerykański rywal Science. Nagrodą dla Mullisa za to rewolucyjne odkrycie był czek opiewający na kwotę dziesięciu tysięcy dolarów, kwota o tyle śmieszna, iż korporacja Cetus, dla której od 1979 pracował, zainkasowała 300 milionów dolarów za sprzedanie patentu firmie Hoffmann La Roche w 1992 r., co stanowi jak do tej pory niepobity wciąż rekord kwoty wypłaconej za patent. Jednak już w 1993 r. wszelkie kłopoty finansowe, o ile Mullis takowe posiadał, na zawsze się skończyły, gdyż w tymże właśnie roku otrzymał on Nagrodę Nobla, czyli czek na milion dolarów. Od tej pory porzucił naukę i oddał się jak sam mówi swoim trzem pasjom : alkoholowi, pływaniu na desce surfingowej i pięknym kobietom.

O co w tym wszystkim chodzi? – czyli kilka słów o procedurze i optymalizacji metody.

Co potrzeba, aby samemu przeprowadzić reakcję polimeryzacji ? Najważniejszym składnikiem mieszaniny reakcyjnej jest bez wątpienia matryca DNA, której fragment chcemy namnożyć. Oprócz matrycy w skład mieszaniny wchodzą : polimeraza DNA (polimeraza Taq), mieszanina trójfosforanów nukleotydów, startery, bufor zawierający jony dwuwartościowe i zapewniający optymalne dla polimerazy pH, wynoszące 8,3. Za co odpowiedzialny jest każdy z powyżej wymienionych składników? Otóż matryca, jak już wcześniej wspomniano, jest niejako planem, w którym zapisano interesujący nas fragment genomu, który pragniemy skopiować. Startery, przyłączając się do matrycy, flankują interesującą nas sekwencję. Polimeraza, trzymając się nomenklatury budowniczej, jest niejako robotnikiem, który buduje interesujący nas fragment matrycy, wykorzystując jako fundamenty wcześniej przyłączone startery. Do budowy wykorzystuje cegły, trifosforany nukleotydów, a bufor zapewnia właściwą i zdrową atmosferę w pracy, dla naszego robotnika. Tak już całkiem na poważnie, to każdy z tych składników jest kluczowy dla przebiegu reakcji, a brak któregokolwiek z nich sprawia, iż jej właściwy przebieg jest niemożliwy.

W 1 cyklu klasycznej reakcji PCR wyróżnić możemy trzy podstawowe etapy :

*Pre I – etap termicznej aktywacji enzymu (polimeraza typu hot start; 94 – 96 0C; 1 – 9 minut;);

I – etap denaturacji; prowadzony w temperaturze od 94 do 98 0C (zależny od ilości par GC) i trwający od 20 do 30 sekund;

II – etap przyłączenia starterów (ang. annealing); prowadzony w temperaturze 50 – 64 0C; trwający od 20 do 40 sekund;

III – etap elongacji; 70 – 74 0C;

*Post III – etap końcowej elongacji (5 – 15 minut);

* etapy opcjonalne

Zwykle na całą procedurę PCR składa się około 30 cykli. Schemat ilustrujący przebieg reakcji przedstawiono poniżej:

Jak pokazuje powyższy schemat w reakcji PCR nie otrzymujemy homogenicznejmieszaniny produktu. Tylko krótkie fragmenty zaznaczone na biało są produktem żądanej długości. Teoretyczny przyrost sekwencji po n cyklach wynosi 2n, jednak jest to prawda jeżeli bierzemy pod uwagę wszystkie produkty, zarówno te „długie” jak i te „krótkie”. Dzięki temu, że ilość produktu wzrasta wykładniczo, jesteśmy w stanie w poniżej godziny uzyskać produkt namnożony około miliard razy!!!

Pomimo tego, iż na pierwszy rzut oka, reakcja ta wydaje się być pozbawiona jakichkolwiek wad, to rzeczywistość wygląda zgoła odmiennie. Wszystko brzmi „fajnie” w teorii i na papierze, natomiast jak to jest w rzeczywistości? Otóż w trakcie wykonywania procedury jesteśmy narażeni na wiele niebezpieczeństw i niedoskonałości wynikającej z ograniczeń samej metody. Dlatego procedura ta stale ewoluuje i przez ponad 20 lat stawała się coraz doskonalsza. Początkowo stosowano polimerazę DNA, która była niestabilna w wysokich temperaturach, stąd też wydajność uzyskiwanego produktu była mniejsza niż teoretycznie zakładano. Związane to było z faktem, iż w trakcie przebiegu procedury, polimeraza ulegała denaturacji termicznej. Dlatego rewolucyjnym krokiem było wprowadzenie do procedury polimerazy Taq wyizolowanej z termofilnej bakterii Thermus aquaticus, której naturalnym środowiskiem życia są między innymi gorące źródła. Polimeraza Taq najefektywniej pracuje w zakresie temperatur od 75 do 80 0C, a jej czas półtrwania wynosi 9 minut w temperaturze 97,5 0C. Wprowadzenie tego enzymu znacznie zwiększyło wydajność reakcji, jednak wiązał się z tym kolejny problem, gdyż polimeraza Taq nie posiada aktywności egznonukleazy 3’ -> 5’, nie może ona więc naprawiać popełnionych przez siebie błędów, a popełnia je dosyć często bo średnio około 1 na 10000 wstawionych nukleotydów jest nukleotydem błędnym. Częstotliwość ta znacznie wzrasta, gdy zamiast jonów magnezu w buforze znajdują się dwuwartościowe jony manganu. Jak poradzono sobie z tym problemem? Otóż zastąpiono polimerazę Taq polimerazą Pfu (Pyrococcus furiosus) lub Pwo (Pyrococcus woesii), które to wykazują aktywność egzonukleazy 3’->5’, lub stosuje się mieszaniny polimeraz Taq i którejś z wcześniej wymienionych, gdyż Taq gwarantuje wysoką aktywność polimerazy, natomiast Pfu lub Pwo są odpowiedzialne za zdolność naprawczą.

Kolejnym problemem, który "spędził sen" z powiek wielu naukowcom, jest powstawanie niespecyficznych produktów, co związane jest z powstawaniem lokalnych struktur drugorzędowych (hairpins) lub z niespecyficznym łączeniem się starterów z matrycą. W celu wyeliminowania lokalnych struktur drugorzędowych zastosowano kilka praktyk. Najprostszą z nich jest dodanie do mieszaniny reakcyjnej DMSO lub glicerolu, które stabilizują strukturę pierwszorzędową, lub po prostu takie zaprojektowanie starterów, aby nie zawierały one w swojej sekwencji odwróconych fragmentów komplementarnych. Nieco bardziej wyrafinowaną metodą było stworzenie metodami inżynierii genetycznej tzw. polimerazy TopoTaq, która stanowi niejako hybrydę polimerazy i topoizomerazy, a co za tym idzie posiadającą aktywność jednego jak i drugiego enzymu. Aktywność topoizomerazy umożliwia rozbijanie lokalnych struktur drugorzędowych, a co za tym idzie powstawanie żądanych produktów. Poza tym aktywność ta znacznie wpływa na wzrost procesywności (ile nukleotydów wbudowuje polimeraza do nowo powstałego konstruktu w trakcie jednorazowego przyłączenia się do matrycy), co sprawia iż ograniczenia wynikające z długości produktu jaki może powstawać w PCR zostają znacznie zminimalizowane (z reguły wydajnie namnażane są fragmenty o długości od 2 – 3 tysięcy par zasad, gdyż wraz ze wzrostem długości produktu maleje wydajnośc procesu; aktywność topoizomerazy sprawia iż możliwe jest namnożenie fragmentów, których długośc sięgać może nawet 50 tysięcy par zasad!!!). Jak jeszcze możemy przeciwdziałać powstawaniu niespecyficznych produktów? Obecnie szerokie zastosowanie znajdują polimerazy typu i hot start. Są to enzymy, które do uzyskania aktywności wymagają wstępnej atywacji termicznej (94 – 96 0C; 1 – 9 minut). Enzymy w formie nieaktywnej stabilizowane są chemicznie wiązaniami kowalencyjnymi lub niekowalencyjnymi (stabilizowane przeciwciałami). Wzrost temperatury powoduje zniesienie tych oddziaływań, a co za tym idzie aktywację polimerazy.

PCR dziś

Powracając do początkowej muzycznej stylistyki tego artykułu, PCR z 1983 doczekał się wielu „remake’ów”, mniej lub bardziej interesujących. Lista przebojów jest naprawdę długa i imponująca, a poniżej zostanie krótko przedstawionych tych 5 spośród nich, które moim zdaniem najbardziej zasłużyły na to, aby na tej liście "TOP FIVE" się znaleźć. Chciałbym jednocześnie zaznaczyć, iż nie jest to lista rankingowa, a jedynie swojego rodzaju wykaz po prostu 5 najbardziej osobliwych „utworów”, które wybrałem kierując się subiektywnymi odczuciami.

1. Assembly PCR

2. Helicase dependant amplification

3. RT PCR

4. Real Time PCR

5. Multiplex PRC

Assembly PCR

Assembly PCR nie jest niczym rewolucyjnym. Można jednak o nim śmiało powiedzieć, że jest genialny w swej prostocie. Otóż nie jest to nic innego, jak wykorzystanie reakcji PCR do połączenia ze sobą krótkich, zachodzących na siebie fragmentów oligonukleotydowych. W pierwszym etapie reakcji dochodzi do hybrydyzacji fragmentów, które są do siebie komplementarne. Następnie polimeraza DNA wykorzystuje te krótkie fragmenty jako primery i wykorzystując zhybrydyzowany z nimi fragment jako matrycę, dobudowuje brakujące fragmenty DNA, w wyniku czego otrzymujemy „pełnowartościowy produkt”, który namnażany jest w kolejnych cyklach reakcji PCR. Schemat opisanego powyżej procesu załączono poniżej:

„Jak widać na załączonym obrazku”, ten rodzaj PCR’u znajduje zastosowanie głównie w „scalaniu” pofragmentowanych np. na skutek cięć DN-azami, fragmentów jakiegoś genu, bądź nawet plazmidu.

Helicase Dependant Amplification

Tak naprawdę to jest to chyba jeden z najdziwniejszych rodzajów PCR-u, bo tak naprawdę w niewielu aspektach go przypomina...ale zacznijmy od początku:

• Mamy DNA? Mamy!
• Mamy bufor dla polimerazy? Mamy!
• Mamy polimerazę? Mamy!
• Mamy startery? No mamy!

No i gdzie te różnice??? Pierwszą jest obecność w mieszaninie reakcyjnej jeszcze jednego enzymu...helikazy. Dzięki temu możliwe jest prowadzenie reakcji w stałej temperaturze, gdyż nie potrzebujemy już podnosić temperatury, aby doprowadzić do denaturacji matrycy, bo robi to za nas helikaza (żeby sprawa była jasna, rozwija DNA, nie podgrzewa mieszaninę reakcyjną), dzięki czemu znacznie oszczędzamy na czasie. Kolejnym plusem obok izotermalnych warunków prowadzenia reakcji, oraz prostoty, wydaje się być ekonomia, gdyż w tym wariancie w ogóle zbędny staje się termocykler, a zaoszczędzone fundusze można przeznaczyć z powodzeniem na coś zupełnie innego. Minusem, jak do tej pory nadal nie wyeliminowanym, jest jednak fakt, iżdo wykorzystania tej metody wymagana jest większa ilość materiału (DNA) niż w przypadku klasycznej metody...

RT PCR vs. Real Time PCR

Jedna z najczęściej, obok Real Time PCR, wykorzystywana obecnie modyfikacja klasycznego PCR’u. Wykorzystuje ona enzym wykorzystywany przez retrowirusy, a mianowicie tzw. odwrotną transkryptazę, która umożliwia „przepisanie” RNA na DNA. Jest to o tyle osobliwe i interesujące, gdyż do czasu kiedy odkryto ten enzym proces ten uważano za niemożliwy, i niezgodny z przyjętym dogmatem genetyki molekularnej, iż przepływ informacji genetycznej zachodzi tylko i wyłącznie w kierunku DNA → RNA → białko. Jej trzeciorzędową strukturę przedstawiono ponizej:

Jakie zastosowanie w laboratorium znalazł ten enzym? Otóż dzięki niemu stało się możliwe „przepisanie” mRNA wyizolowanego z komórek na pozbawione intronów, tzw. cDNA (copy DNA). No dobrze ale po co nam to było? Czy przypadkiem nie komplikujemy sobie życia? Odpowiedź na to pytanie brzmi...nie! W tym przypadku jednak można by zamienić ją na zgrabnie dobrany zestaw słów...REAL TIME PCR, co w żargonie laboratoryjnym znaczy „PCR w czasie rzeczywistym”. I wszystko jasne... Co nam daje Real Time, czego nie daje nam RT PCR? Tak postawione pytanie wydaje się nie mieć większego sensu, gdyż odpowiedź jest taka, iż jeden bez drugiego nie znaczy w zasadzie nic, no albo przynajmniej niewiele. Dzięki "Real Time'owi" możliwe jest stworzenie profilu ekspresyjnego danej komórki, to znaczy ile wybranego przez nas mRNA znajduje się w danej komórce, w odniesieniu do produktu genu referencyjnego, którym zazwyczaj jest gen ef-2. Wynikiem jaki „wypluwa” dla nas maszyna po około 2, 5 godziny ciężkiej pracy, jest seria wykresów, których początek na osi OX wskazuje ile danego mRNA znajdowało się pierwotnie w komórce (oczywiście po zastosowaniu odpowiednich przekształceń matematycznych). W oznaczeniu tym wykorzystuje się barwniki fluorescencyjne, które interkalując z DNA dają sygnał, wychwytywany przez detektor zainstalowany w maszynie. Przykładem takiego barwnika jest m.in. W oznaczeniu tym wykorzystuje się barwniki fluorescencyjne, które interkalując z DNA dają sygnał, wychwytywany przez detektor zainstalowany w maszynie. Przykładem takiego barwnika jest m.in. SYBR green. Przykładowy wynik uzyskany w procedurze Real Time PCR zamieszczono poniżej:

Multiplex PCR

Bardzo ciekawym wariantem reakcji PCR jest właśnie multiplex PCR. W największym skrócie jest to po prostu zwykła reakcja PCR, z tą tylko różnicą, iż namnażamy w tym samym czasie nie jeden, ale aż do 16 różnych loci !!! Tak jak w Real Time PCR, stosuje się w niej detekcję fluorescencyjną do określenia ilości namnożonego fragmentu. Wszystko brzmi świetnie, ale ogrom pracy jaki trzeba włożyć każdorazowo w zaprojektowanie tego typu reakcji, spędził niejednokrotnie, niejednemu naukowcowi sen z powiek. Mimo wszystko „gra jest warta świeczki”. Dlaczego? Między innymi dlatego, iż multiplex PCR świetnie „odnalazł się” jako narzędzie w genetyce sądowej i kryminalistyce. Poza tym coraz więcej firm wyprodukowało gotowe „kity”, które znacznie ułatwiają dobór warunków prowadzenia reakcji. A teraz trochę magii liczb...jakie jest prawdopodobieństwo, iż oznaczony przez nas profil STR należy do danego osobnika, albo inaczej jakie jest prawdopodobieństwo tego, iż ten profil posiadają dwie przypadkowo wybrane przez nas osoby (nie licząc bliźniąt jednojajowych) ? Otóż prawdopodobieństwo to wynosi od 1 na 9.6x10¹⁰ przypadków, do 1 na 2.1x10^17 przypadków, w zależności od tego ile STR-ów oznaczamy i jakim „kitem” się posługujemy. Myślę, że jakikolwiek komentarz argumentujący przydatność tej metody jest po prostu zbędny...

*Jak wspominałem wcześniej lista ta jest całkowicie subiektywna i opiera się wyłącznie na samolubnych i egoistycznych odczuciach autora...

PCR jutro?

Pomimo tego, iż ten akapit wydaje się traktować o przyszłości, to nie sposób w nim nie wspomnieć o modyfikacjach, które już obecnie stosuje się z powodzeniem w laboratoriach na całym świecie, o których omówienie stało się niemożliwe ze względu na ramy objętościowe tego artykułu. Należy wymienić jednym tchem takie „hity” jak LCR (ligase chain reaction), inverse PCR, nested PCR, touchdown PCR, assymetric PCR itp. itd.. Dzięki nim możliwe stało się zidentyfikowanie mutacji punktowych, diagnoza chorób w okresie prenatalnym, określenie miejsc insercji genomu wirusowego, czy sekwencjonowanie genomów różnych organizmów. Coraz częściej „dochodzą nas słuchy”, iż niedługo możliwe stanie się przeprowadzenie reakcji PCR in vivo, co jeśli okaże się prawdą będzie miało niesamowity wpływ na dalsze koleje PCR’u i jego udoskonalenia.

Co przyniesie jutro? Nikt tego nie wie. Jestem jednak w stu procentach przekonany, iż jeśli chodzi o PCR to zaskoczy on nas jeszcze wielokrotnie...oby jak najmilej, czego sobie i Wam życzę!

Literatura:

http://en.wikipedia.org/wiki/Polymerase_chain_reaction

"Biochemia" - L. Stryer, J. M. Berg, J. L. Tymoczko;

http://images.google.pl/imgres?imgurl=http://fonosfera.pl/historia/64/r1.jpg&imgrefurl=http://fonosfera.pl/historia/1964.html&h=298&w=500&sz=26&hl=pl&start=1&um=1&tbnid=K7px39MECG-ADM:&tbnh=77&tbnw=130&prev=/images%3Fq%3Drolling%2Bstones%26svnum%3D10%26um%3D1%26hl%3Dpl%26rlz%3D1T4SKPB_enPL212PL212%26sa%3DNhttp://images.google.pl/imgres?

http://www.iplay.pl/img/patronat/stones/rolling_stones1_d.jpg&imgrefurl=http://www.iplay.pl/konkurs,rolling,stones&h=313&w=400&sz=31&hl=pl&start=46&um=1&tbnid=-Hm0668nShyoqM:&tbnh=97&tbnw=124&prev=/images%3Fq%3Drolling%2Bstones%26start%3D36%26ndsp%3D18%26svnum%3D10%26um%3D1%26hl%3Dpl%26rlz%3D1T4SKPB_enPL212PL212%26sa%3DN__

http://nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/1993/mullis-autobio.html

http://images.google.pl/imgres?imgurl=http://www.i-med.ac.at/genepi/genepi/genotyping_unit/images/gdcf_real_time_pcr_rechts_661x356.jpg&imgrefurl=http://www.i-med.ac.at/genepi/genepi/genotyping_unit/index.html&h=356&w=661&sz=229&hl=pl&start=10&um=1&tbnid=wkX83ytWik2egM:&tbnh=74&tbnw=138&prev=/images%3Fq%3Dreal%2Btime%2Bpcr%26svnum%3D10%26um%3D1%26hl%3Dpl%26rlz%3D1T4SKPB_enPL212PL212%26sa%3DN

www.nhasinhhoctre.com

Wizualizację struktury trzeciorzędowej enzymu odwrotnej transkryptazy uzyskano przy wykorzystaniu bezpłatnego programu Pymol dostępnego w sieci.

---

• Kategorie: Genetyka

---