Articles wiki

Wstęp

Rok 1983 zaowocował kilkoma „wiekopomnymi” wydarzeniami, takimi jak prezentacja komputera biurowego z myszką przez firmę Apple czy choćby założeniem zespołu Red Hot Chili Peppers. Nie wypada także nie zaznaczyć, że to właśnie w roku 1983 przywódca Solidarności Lech Wałęsa został uhonorowany za swoją działalność pokojową nagrodą Nobla. Tymczasem w gorącej Kalifornii w firmie Cetus, Kary Mullins szykował dla świata nauki jedno z najważniejszych i przełomowych narzędzi w biologii molekularnej. Z pomocą swoich współpracowników przyszły Noblista wyizolował z bakterii Thermus aquaticus, żyjącej na co dzień w gorących źródłach, odporną na wysokie temperatury polimerazę DNA – enzym służący do syntezy, a czasem naprawy DNA w komórce, i „zaprzągł go do roboty”. Polimeraza Taq (nazwa pochodzi od wyżej wspomnianej bakterii) dzięki odporności na wysoką temperaturę może przeprowadzać reakcję polimeryzacji DNA w ekstremalnych warunkach termalnych nie ulegając przy tym denaturacji, co z pewnością spotkałoby polimerazę z komórek np.człowieka. Kary Mullins wykorzystał tę cechę do zaprojektowania procesu, który w efekcie będzie w stanie wielokrotnie powielić krótkie fragmenty DNA w zwykłej laboratoryjnej probówce, podobnie jak dzieje się to w komórkach podczas procesu replikacji DNA.

Mechanizm łańcuchowej reakcji polimeryzacji

Proces ten, nazwany PCR (ang. Polymerase Chain Reaction) - reakcja łańcuchowa polimerazy , zaskakuje prostotą swoich założeń. Wystarczy zmieszać ze sobą wszystkie niezbędne do syntezy DNA składniki czyli trifosforany czterech deoksyrybonukleotydów (Adeniny, Tyminy, Guaniny i Cytozyny) będących cegiełkami budującymi DNA , startery (ang. primer) reprezentowane przez krótkie odcinki DNA komplementarne do miejsc w matrycowym DNA, które otaczają interesującą nas sekwencję genu, a także sam DNA w którym znajduje się interesujący nas fragment. Ważną rolę pełnią również jony magnezu i odpowiednio dobrany bufor. Następnie podgrzewamy tak otrzymaną mieszaninę do 95°C, w efekcie czego pękają wiązania wodorowe utrzymujące matrycowe DNA w formie dwuniciowej helisy i powstają dwie jednoniciowe cząsteczki, by po szybkim obniżeniu temperatury do około 55°C (w zależności od primerów temperatura na tym etapie może wahać się w zakresie od 45°C - 70°C) doprowadzić do ich połączenia się z komplementarnym starterem i po podniesieniu do temperatury 72°C doprowadzić do powstania kompleksu Polimeraza-DNA/Primer, który jest strukturą wyjściową do syntezy nowej, komplementarnej do wzorca podwójnej nici DNA. Po tym cyklu liczba interesującego nas fragmentu DNA podwaja się.

Wyobraźmy sobie teraz, że taki cykl powtarzamy około 30 razy, za każdym razem podwajając nasz fragment DNA. Ile kopii otrzymamy? Gdyby wydajność tej reakcji była stuprocentowa, otrzymalibyśmy 2^30 czyli 1 073 741 824 kopii jednego, wybranego przez nas fragmentu DNA! Dzięki odkryciu Kary’ego Mulinsa dziś, w prawie każdym laboratorium biologii molekularnej na świecie, możemy powielić jeden, wybrany fragment DNA ponad miliard razy. A to wszystko zajmuje tylko kilka godzin. Obecnie technika PCR znajduje wiele zastosowań, m.in. w klonowaniu genów, diagnostyce klinicznej, kryminalistyce, identyfikacji zwłok, badaniach nad pokrewieństwem genetycznym między różnymi organizmami, w badaniach na potwierdzenie ojcostwa i wielu, wielu innych.

Zmiany, zmiany, zmiany...

W nauce, podobnie jak w przyrodzie wszystko podlega ewolucji. Z prostych podmiotów wyjściowych powstają formy coraz bardziej wyspecjalizowane. Podobnie było z PCR. Na bazie tej techniki wyrosły inne, służące osiąganiu coraz bardziej wyszukanych celów badawczych. Najbardziej znaną odmianą jest chyba metoda RT – PCR (ang. Reverse Transcriptase PCR) czyli łańcuchowa reakcja polimerazy z wykorzystaniem odwrotnej transkryptazy. Odwrotna transkryptaza jest enzymem występującym u RNA-wirusów (np. Lentiwirus taki jak HIV) i służy im do przepisania informacji z mRNA na DNA. Po przeprowadzeniu RT PCR otrzymujemy cDNA – odcinek kodujący składający się tylko z połączonych egzonów, czyli kodujących fragmentów genu. cDNA amplifikujemy następnie w normalnej procedurze PCR opisanej powyżej.

Real Time PCR - szczyt ewolucji?

Kolejną i obecnie zdobywającą coraz większą popularność i uznanie metodą jest PCR w czasie rzeczywistym (ang. Real time PCR). Metoda ta „wyewoluowała” z konwencjonalnej reakcji PCR, przy czym dzięki wykorzystaniu różnych technik fluorescencji pozwala na monitorowanie przyrostu ilości produktu reakcji w czasie. Po każdym cyklu amplifikacji, specjalne urządzenie dokonuje pomiaru fluorescencji, której intensywność jest wprost proporcjonalna do ilości kopii DNA. Dzięki możliwości śledzenia reakcji „na żywo” Real time pozwala oszacować ilość badanego fragmentu DNA, jaka znajdowała się w próbce na samym początku. W klasycznej PCR nie istnieje taka możliwość, ponieważ w trakcie procesu substraty ulegają zużyciu i w efekcie wydajność nie wynosi 2^n (gdzie n = liczbie cykli) lecz jest mniejsza. Do detekcji amplifikowanych fragmentów DNA używa się tam głównie elektroforezy w żelu agarozowym. Ważną zaletą PCR w czasie rzeczywistym jest fakt, że zarówno amplifikacja jak i detekcja produktu odbywa się w jednym naczyniu, co ogranicza ryzyko zanieczyszczenia praktycznie do zera. Detekcja przyrostu liczby kopii umożliwiona jest tu dzięki zastosowaniu starterów wyznakowanych fluorescencyjnie lub odpowiednich fluoryzujących związków chemicznych wykazujące wysokie powinowactwo do podwójnej nici DNA.

Real Time od kuchni

Od strony technicznej Real time wymaga termocyklera, który w swojej budowie sprzężony będzie z fluorymetrem – urządzeniem służącym do pomiaru fluorescencji. Każdy układ mierzący fluorescencje zawiera w sobie źródło światła wzbudzającego (odpowiednie lampy, diody LED lub lasery) oraz detektor rejestrujący określoną długość emitowanego światła. Aby obliczyć ilość badanych cząsteczek musimy najpierw wyznaczyć pewien próg (CT), po którego przekroczeniu reakcja wchodzi w fazę logarytmicznego wzrostu i następnie wyznaczyć krzywą standardową na podstawie wykonania Real time dla kilku próbek o znanej początkowej liczbie kopii DNA, po czym odnieść do otrzymanej krzywej standardowej wyniki z właściwej reakcji Real time PCR.

Barwniki Fluorescencyjne czyli nie wszystko złoto, co się świeci

Do fluoroforów (barwników zdolnych do emitowania światła po wzbudzeniu) stosowanych w Real time PCR zaliczamy:

• SYBR green I i bromek etydyny są najprostszymi fluoroforami które emitują światło po związaniu z dwuniciową strukturą DNA

• Sondy TaqMan wykorzystują zjawisko transferu energii rezonansu fluorescencji (ang. FRET), są to krótkie oligonukleotydy zawierające na końcu 5’ fluorofor a na końcu 3’ wygaszasz fluorescencji. Po związaniu z sekwencją docelową sonda jest degradowana przez polimerazę DNA na końcu 5’ w efekcie czego fluorofor i wygaszasz zostają oddzielone od siebie i może zajść fluorescencja.

• Sondy HybProbes opierają się o dwa krótkie łańcuchy znakowane fluorescencyjnie, jedna na końcu 3’, a druga na końcu 5’. Sondy te są komplementarne do DNA w taki sposób, że po przyłączeniu się do swoich miejsc docelowych sąsiadują ze sobą w odległości, która wystarcza do wzbudzenia flurescencji jednego fluoroforu przez drugi na zasadzie transferu energii (FRET).

• Sondy HyBeacon to pojedyncze, liniowe oligonukleotydy z fluoroforem umieszczonym na środku sondy.

• Molecular beacons w ich przypadku fluorofor jest zlokalizowany na końcu 5’, a wygaszacz na końcu 3’. Oba końce są do siebie komplementarne, więc tworzą strukturę spinki do włosów, w której następuje wygaszenie. Po związaniu części wolnej spinki z docelową sekwencją komplementarną, następuje rozdzielenie końców i emisja światła przez fluorofor.

Real Time PCR jako narzędzie w badaniach wirusologicznych

W laboratoriach diagnostyki klinicznej, metody oparte na PCR są zazwyczaj używane jedynie do stwierdzenia obecności diagnozowanego patogenu lub jej braku w organizmie pacjenta, w zależności od obecności charakterystycznych dla niego genów. Taki rodzaj badań ma jedynie charakter jakościowy. Rozwój Real time PCR umożliwił nie tylko identyfikację docelowych sekwencji, ale także ich policzenie, jak sam nazwa wskazuje, w czasie rzeczywistym. Dzięki możliwości szybkiego i dokładnego oszacowania ilości kopii DNA znajdujących sie w próbce na początku cyklu, możemy oszacować ile ich przypada nawet na pojedynczą komórkę, dlatego Real time wydaje się być idealnym rozwiązaniem dla klinicystów. Real time oferuje znaczącą poprawę czułości i dzięki temu pozwala wykryć już kilka kopii wirusowych transkryptów. Możemy określić ilość kopii danego fragmentu genu w próbce na dwa sposoby - względny i absolutny. Względny jest prostszy i opisuje zmiany ilości sekwencji docelowej w odniesieniu do jego ilości w pewnej macierzy odniesienia. Absolutny natomiast, obrazuje dokładną liczbę kopii DNA w próbce w odniesieniu do ustalonej jednostki. Ten typ jest szczególnie przydatny w monitorowaniu rozwoju zakażeń wirusowych, rozróżnianiu zakażenia objawowego i bezobjawowego oraz ustaleniu na jakim etapie życia utajonego znajduje się wirus w komórce. Ponadto ustalenie jednej jednostki jest przydatne we współpracy między naukowcami z różnych ośrodków badawczych. W przypadku gdy w komórce mamy olbrzymi nadmiar wirusowego DNA, Real time potrafi skutecznie wykryć tylko jedną sekwencje ustaloną wcześniej przez badacza. PCR w czasie rzeczywistym służy także do badań zakresu infekcji, interakcji wirus gospodarz, odpowiedzi na terapię przeciw wirusowe, a także jest znaczącym narzędziem w monitorowaniu zakażeń i rozwoju choroby wirusowej. Dzięki badaniom z użyciem Real time’a udowodniono, że pogorszenie się stanu pacjentów w przypadku niektórych chorób wirusowych jest ściśle skorelowana z pojawieniem się i zwiększaniem liczby pewnych transkryptów wirusowych (ma to szczególne znaczenie w monitorowaniu chorób wirusowych). Kolejnym zastosowaniem jest możliwość zbadania przebiegu reaktywacji w wirusowych zakażeniach przetrwałych. Mamy z nimi do czynienia wtedy, gdy wirus pozostaje w ciele gospodarza na bardzo długi czas (wirus zapalenia wątroby typu B), a nawet na całe życie (wirusy z rodziny Herpesviridae). Jako przykład może posłużyć ludzki wirus Cytomegalii, do którego wykrycia stosuje się omawianą technikę. Grupą docelową są tu pacjenci poddani immunosupresji przed przeszczepem szpiku lub narządów litych np. nerek. Bada się w ten sposób skuteczność terapii przeciw wirusowej, a także monitoruje się stan pacjenta, w celu określenia, czy po przeszczepie nie rozwija się zagrażająca życiu choroba cytomegaliowa. Zastosowanie multipleksowego Real time’a (multipleks oznacza, że w próbce znajdują się startery dla kilku różnych genów) pozwala za jednym podejściem wykryć obecność, a także stan „życia” takich wirusów jak ludzki wirus opryszczki HSV, wirus ospy wietrznej/półpaśca VZV, oraz wirus cytomegalii CMV i wirus Epsteina-Barr EBV. Multipleks Real time PCR pozwala także na rozróżnienie infekcji wirusami różnych szczepów np. EBV typ A od EBV typ B, czy na badanie różnic w infekcji wirusami grypy typu A i B.

Podsumowanie

Rozwój techniki PCR w czasie rzeczywistym i jego ekspansja jest już kwestią czasu. W przyszłości, dzięki tej technice, będzie można dokładnie badać aktywność określonych genów wirusa w sztucznie przygotowanych przez naukowców warunkach, a także w ciele pacjenta i odpowiednio reagować na poczynania patogenu. Real time PCR umożliwi też przyśpieszenie i zwiększenie zasięgu badań określających różne szczepy wirusa i różnorodność objawów ich infekcji. Skorzysta na tym także epidemiologia. Już dziś PCR w czasie rzeczywistym jest jednym z głównych narzędzi stosowanych w badaniach flavivirusów, hepadnawirusów, herpeswirusów, orthomyxowirusów, parvowirusów, wirusów papowa paramyxowirusów, picornawirusów oraz retrowirusów, a także pacjentów oczekujących na przeszczep i tych, którzy przechodzą rekonwalescencję już po zabiegu.

Piśmiennictwo

1. Lubert Stryer, John L.Tymoczko, Jeremy M. Berg "Biochemia" PWN 2005

2. Ian M. Mackay, Katherine E. Arden and Andreas Nitsche "Real-time PCR in virology"

3. Mark A. Valasek and Joyce J. Repa "The power of real-time PCR"

4. Real-time PCR Prywatna strona Marcina Schmidta

5. Real time PCR Wikipedia, wolna encyklopedia