Genom i co dalej?

Znamy w miarę dokładnie informację zawartą w kodzie genetycznym. Znamy, ale nie jesteśmy dalej zbyt biegli w jej interpretacji. I wcale nie wydaje się by miało się to w najbliższym czasie zmienić. Jaka jest tego przyczyna? Przyjrzyjmy się, jaką drogę przebywa informacja zawarta w DNA. Opisuje to w przybliżony sposób schemat, zwany czasem dogmatem biologii molekularnej

• .

• 1. Dogmat biologii molekularnej

Nie jest to jednak takie proste, jakby mogło się z tego rysunku wydawać. Z kawałka kodu genetycznego, kodującego jeden składnik struktury, białko, niekoniecznie powstaje jeden typ RNA, niekoniecznie z jednego typu RNA powstaje jedno białko. Wszystkie cząsteczki występujące po drodze mogą nie tylko pełnić funkcję budulcową, ale także regulującą powstawanie nich samych oraz innych im podobnych. Można by nawet pokusić się o stwierdzenie że dzieje się tak z reguły. Nie wspominając już o sieci oddziaływań ze sobą i ze środowiskiem. A ona właśnie determinuje to, co się w organizmie dzieje, a to właśnie najbardziej chcemy wiedzieć. Nie wydaje się być dobrym pomysłem próba określania tego wszystkiego „od zera”. Próbować wiedząc to, co wiemy przewidzieć wszystkie możliwe oddziaływania. Jest to zadanie póki co niemożliwe do zrealizowania.

Transkryptom, proteom, metabolom.

Te trzy pojęcia oznaczają najprościej ujmując, kolejne klasy „zawartości” organizmu, narządu, tkanki czy komórki, ustawione w kolejności, w jakiej kod genetyczny na nie wpływa. Transkryptom, zawiera wszystkie obecne transkrypty RNA, czyli służące do syntezy białka matryce powstałe na bazie kodu genetycznego. Proteom to zbiór białek występujących w badanym ‘obszarze’, powstałych z obecnych w tym samym czasie lub wcześniej transkryptów RNA . Metabolom jest nieco bardziej abstrakcyjny- chodzi tu o wszystkie małe cząsteczki, takie jak produkty przemiany materii, hormony, a także leki i produkty odpadowe.

Cele i metody badania.

Najogólniej, chcemy móc szybko, sprawnie i dokładnie określać, to co w próbce mamy, badać jak zmienia się to w zależności od warunków środowiska, etapów rozwoju organizmu, czego tylko dusza zapragnie. Jak można się domyśleć, określanie np. po kolei stężenia każdego spośród tysięcy białek które zapewne znajdują się w naszej próbce zajęłoby wieki i kosztowało ogromne pieniądze. Nawet jeśli mamy jakiś pomysł, co można by dokładnie sprawdzić, np. wiemy, że lek, który badamy po jakimś czasie polepsza wchłanianie jakiegoś związku z jelita= czy nie prowadzi on aby do zwiększenia ekspresji genu kodującego białko wyspecjalizowane z transporcie tego związku. Takie podejście sprawdza się, lecz nie jest dla nas wystarczające. Jest to sposób dokładny i pewny, lecz sprawdzimy, czy dzieje się to co przypuszczamy, lecz nie sprawdzimy, czy nie dzieje się także coś innego. Potrzebujemy więc metod umożliwiających masowy pomiar lub chociaż określenie obecności lub nieobecności badanych składowych, czyli białek, cząsteczek RNA, lub metabolitów. Takie podejście, daje dużo informacji, jest szybkie, lecz dzieje się to za ceną trudnej interpretacji i niekiedy niepewności wyników, które wymagają potwierdzenia. Jakkolwiek, jeśli wiemy, co potwierdzać, staje się to dużo prostsze.

Spróbujemy zawrzeć tu pewien przegląd technik, które nam służą, by zdobyć takie dane.

TRANSKRYPTOM

1.Bloty

• 

  • 2. Northern blot

Zasada tej techniki jest prosta: wykorzystujemy skłonność komplementarnych cząsteczek kwasów nukleinowych do łączenia się ze sobą. Potrzebujemy do togo celu próbki zawierającej wyizolowane, możliwie czyste cząsteczki RNA, oraz sondę: pozyskany dowolną techniką odcinek kwasu nukleinowego, komplementarny(więc będzie się łączy z szukaną cząsteczką, zakładamy, że jedynie z nią), oraz zmodyfikowany w sposób umożliwiający pomiar jego ilości, np., zawierający radioaktywny izotop, którego promieniowanie będzie można mierzyć, lub dołączoną małą, fluoryzującą cząsteczkę. Naszą próbkę rozdzielamy najczęściej przez elektroforezę w żelu* przenosimy na wygodniejszy nośnik, np. membranę nylonową, inkubujemy z roztworem sondy, a następnie badamy ile sondy się przyłączyło.

MIKROMACIERZE

W zasadzie, jest to rodzaj „zmasowanego” blotu, z pewną modyfikacją, ponieważ nie badane RNA, a sondy są przymocowane na stałe do jakiegoś nośnika. W tej technice, potrzeba jest nam po pierwsze: matryca, na której pola naniesione są nieznakowane niczym cząsteczki sondy. Możemy oznaczać tyle różnych typów transkryptów, ile pól ma matryca. Wykonanie takiej matrycy decyduje niestety w znacznym stopniu o kosztowność i tej metody. Następnie potrzebujemy wyznakowanych cząsteczek, których ilość chcemy badać. I tu powstaje problem: jak je wyznakować? Organizm badany z reguły sam tego nie uczyni. Rozwiązanie jest dość proste. Wykorzystujemy tu enzym, odwrotną transkryptazę, mający zdolność do tworzenia komplementarnej nici DNA na bazie nici RNA. Podsuwamy mu znakowane zasady azotowe klocki, z których zbuduje on DNA. Mogą zawierać izotop lub być zmodyfikowane, by fluoryzowały. Przyłączamy do matrycy, i mierzymy dawany przez nie sygnał. W teorii proste, w praktyce wymaga wiele zachodu, ale efekty są bardzo dobre: duża przepustowość pomiaru przy bardzo małej utracie czułości i pewności danych.

• Możliwe są też rozmaite modyfikacje tej metody, umożliwiające Np. bezpośrednie porównanie profili ekspresji w dwóch próbkach. Uzyskujemy to w następujący sposób: DNA pochodzący z 1 próbki jest np. wyznakowany kolorem zielonym, a DNA pochodzący z 2 próbki kolorem czerwonym. Pojedyncze pola na matrycy będą miały kolor zależny od stosunku, w jakim DNA z poszczególnych próbek przyłączyło się, a z tego możemy odczytać, w której próbce było go więcej. Na 1 macierzy możemy umieszczać bardzo wiele sond. Wersje zawierające nawet po kilkadziesiąt tysięcy różnych pól nazywamy zwykle mikromacierzami. Warto zauważyć, że sekwencja sondy nie musi dokładnie „pasować” do poszukiwanej sekwencji. Krótkie sondy, tolerujące niedopasowania, mogą przyłączać wiele różnych podobnych sekwencji. To, wraz z możliwością bezpośredniego badania różnic w ekspresji, w sposób, jaki opisano powyżej, oraz przy zaprzęgnięciu komputerów do analizy bardzo skomplikowanych w tym wypadku danych pozwala na bardzo szybkie porównywanie ekspresji wielu genów. Wadą tych metod jest ogromy koszt aparatury potrzebnej do prawidłowego przeprowadzania takich doświadczeń.

  • 

3. Mikromacierz

Proteom, czyli białka

I ZNOWU BLOT..

Przeciwciała, czyli białka odpornościowe znajdujące się we krwi, mają niezwykle przydatną nam zdolność do bardzo swoistego łączenie się z różnymi substancjami, zwłaszcza wielkocząsteczkowymi, czyli np. białkami. Wykorzystuje się to w sposób niezwykle podobny jak komplementarność w wypadku kwasów nukleinowych- białka rozdzielone za żelu (więcej o rozdziale na żelu znajdzie się poniżej), przenosimy na wygodniejszy (białka są na powierzchni, bardziej dostępne) kawałek membrany, po czym sprawdzamy gdzie przyłączają się (wyznakowane znów w jakiś sposób) przeciwciała, oraz badamy siłę sygnału

4. Western blot

ALE POTRZEBUJEMY CZEGOS BARDZIEJ ZAAWANSOWANEGO, A W TYM MOMENCIE NIE OBEJDZIE SIE BEZ:

METOD ROZDZIALU

Są nam potrzebne jeśli chcemy analizować bardziej skomplikowane mieszaniny bialek, a ztakimi mamy najczęscien do czynienia w badaniach proteomicznych.Postaramy się tu omówić te najpopularniejsze obecnie.

Chromatografia, zwłaszcza wysokociśnieniowa.

Ogólnie metoda opiera się na tym, że substancje, które chcemy rozdzielić, przypływają przez kolumnę wypakowana substancją, do której wykazują pewne powinowactwo, łączą się z nią słabo, co powoduje, że są przez nią w różnym stopniu hamowane. Efekt jest prosty do przewidzenia: substancje, które weszły do złoża w Jednem momencie, opuszczą je w różnym czasie, co pozwoli na je rozdzielić. Jeśli użyjemy odpowiednich, ciasno upakowanych złóż, oraz wysokiego ciśnienia, możemy uzyskiwać ogromną rozdzielczość- fragmenty białek o długości kilkunastu aminokwasów, a różniące się tylko jednym z nich, mogą być skutecznie rozdzielone. Technikę tą nazywamy HPLC (high performance liquid chromatography

• 

• 5.HPLC

Wiemy, że na naładowane cząsteczki są podawane pewnej sile w polu elektrycznym. Przyglądając się wzorom aminokwasów, widzimy, że istnieje wiele grup, które mogą ulegać jonizacji, tracąc lub przyłączając proton. Stałe dysocjacji są bardzo różne, powoduje to, że zwykle różne białka różnią się ładunkiem w tym samym pH. Umieszczając je w polu elektrycznym powodujemy ich ruch z różną prędkością, co umożliwia rozdział. W praktyce wykonuje się to w ten sposób, że próbkę umieszcza się w zagłębieniu żelowego nośnika, łatwo nasiąkającego zawierającym jony (a więc przewodzącego) buforu, po czym przykłada napięcie powodujące ruch cząsteczek. Prędkość ich migracji zależeć będzie od ładunku (siła, jaka na nie działa), oraz wielkości(od niej zależy opór, jaki stawia żelowy nośnik). Po pewnym czasie prąd odłączamy i uzyskujemy kawałek żelu, na którym rozdzielone są białka, możemy je wybarwić i obserwować, wykonać blot, lub wyizolować do dalszych badań. Jednak, jako że w 1 komórce mamy kilkadziesiąt tysięcy białek, możliwości rozdzielcze tej metody nie są wystarczające by stosować ją samodzielnie. Najczęściej stosowaną modyfikacją elektroforeza dwuwymiarowa. Polega ona na rozdziale białek w jednym kierunku, najczęściej na podstawie punktu izoelektrycznego(opisano ponizej), a następnie w drugim kierunku względem masy.

• 

  • 6. Elektroforeza 2D

Zauważmy, jako że ładunek każdej ulegającej jonizacji reszty, a więc ładunek cząsteczki białka zależy od pH, to istnieje takie pH, w którym ładunek wypadkowy jest równy zeru. Jeśli umieścimy próbkę na pasku z nieruchomym gradientem pH, a następnie przyłożymy napięcie, cząsteczki będą migrować do punktu, w którym ładunek wypadkowy jest równy zeru i tam, jako że nie poddawane sile, migracji zaprzestaną. Następnie przyklejamy pasek do arkusza następnego, innego żelu- tym razem zawierającego SDS- ujemnie naładowany detergent, który powoduje 2 rzeczy- denaturuje, rozwija łańcuchy białkowe, nadając im wszystkim jednakowy prętopodobny kształ, oraz opłaszcza je w stałym stosunku masa białka/masa SDS, nadając im wszystkim mniej więcej jednakową gęstość ładunku na powierzchni. W tym momencie po podłączeniu napięcia, białka będą rozdzielane za względu na masę. Po wybarwieniu otrzymujemy cos takiego:

• 

• 7.Wynik elektroforezy 2D

Na podstawie obecnośći i intensywnośći plamek wnioskujemy o ilośći białka. Możliwa jest także jego wstępna indentyfikacja, na podstawie wyznaczonej masy i pI, lecz jest ona dość niepewna. Dokładniejszą identyfikację można przeprowadzić stosując jedną z metod opisanych poniżej:

Sekwencjonowanie metodą chemiczną

Metodą zwaną degradacją Edmana możemy wyznaczyć sekwencję długości kilkudziesięciu aminokwasów. W Dość sporym uproszczeniu przebiega to następująco: Białko denaturujemy, rozbijamy strukturę trzeciorzędową, po czym trawimy enzymem o dobrze zdefiniowanych miejscach cięcia, np. trypsyną, na fragmenty o długości kilkudziesięciu aminokwasów, po czym fragmenty te są:

-rozdzielane,

-przyłączane(już identyczne, po rozdziale) do stałego nośnika,

-traktowane odpowiednim odczynnikiem modyfikującym ostatnia wolną resztę aminokwasową

-traktowane kolejnym związkiem powodującym oderwanie ostatniej zmodyfikowanej reszty

-po czym każdym takim cyklu pochodna jest identyfikowana metodami chromatograficznymi. Umożliwia to skuteczną, lecz długotrwałą identyfikację lub zsekwencjonowanie nieznanego białka. Wymaga niestety dość dużej ilości materiału.

Spektrometria masowa.

Może służyć zarówno do sekwencjonowania jak i do identyfikacji białek w nieco prostszy sposób, który zaraz opiszemy. W ogólnośći, spektrometria mas umożliwia nam określenie stosunku masa/ładunek dowolnej zjonizowanej cząsteczki, co często umożliwi nam po prostu wyznaczenie jej masy. Ideę pomiaru wyjaśnia rysunek:

8. Idea spektrometrii masowej

• Analiza próbki zawierającej trawione enzymem białko lub mieszaninę białek daje nam rozdział zawierajże piki odpowiadające różnym stosunkom masa/ładunek. Takie widmo może być przy użyciu komputera porównane z bazą zawierającą dane dla znanych białek, co często będzie wystarczające dla identyfikacji. Niektóre stosowane instrumenty maja możliwość dalszej fragmentacji uzyskanych jonów oraz określania , stosunku masa/ładunek uzyskanych fragmentów. Te dane pozwalają często przy użyciu odpowiedniego oprogramowania na wydedukowanie sekwencji białka jako, że dla peptydu o danej z dostateczną dokładnością masie istnieje skończona możliwa liczba sekwencji, wielokrotne fragmentowanie oraz pomiary pozwalają na dedukcję przy użyciu odpowiedniego oprogramowania sekwencji peptydu, a nastepnie całego białka.

Wszystkie powyższe metody generują masy danych, których interpretacja nie obejdzie się bez odpowiedniego oprogramowania, oraz osobnika, który umie go świadomie używać. Potrzebujemy odpowiedzi na przynajmniej niektóre z tych pytań:

-co było w próbce? Tzn, Ile i jakich RNA, białek

-co się zmienia, pod wpływam znanego bodźca

-co te zmiany oznaczają?

W sumie dobry sposób, by dokonywać w biologii ciekawych odkryć, biologiem nie będąc.