• Rośliny transgeniczne

    Justyna Sojka

    Artykuł ma za zadanie przybliżyć metody otrzymywania roślin transgenicznych i ich wykorzystanie, a także zarysować problemy i niebezpieczeństwa, jakie wiążą się z rozpowszechnieniem roślin transgenicznych w przyrodzie.

1. Co to są rośliny transgeniczne?

Według Nowej encyklopedii powszechnej PWN (Wydawnictwo Naukowe PWN SA):

" TRANSGENICZNE ORGANIZMY , genet. rośliny bądź zwierzęta zawierające w swych komórkach włączony do chromosomów gen obcego organizmu. Transgeniczne organizmy otrzymuje się metodami inżynierii genetycznej. (...) U roślin najczęściej wprowadza się obcy gen za pomocą wektora plazmidowego z bakterii

Człowiek od bardzo dawna czerpie korzyści z modyfikacji genomu innych organizmów. Praktycznie wszystkie zwierzęta i rośliny hodowlane są genetycznie zmodyfikowane w procesie udomowienia, krzyżowania, selekcji w celu uzyskania pożądanych cech oraz hodowania w określonych warunkach przez długie okresy czasu oraz sztucznie wywołanych mutacji za pomocą czynników antropogenicznych np. przez naświetlanie promieniowaniem UV. Uzyskanie nowego typu zmienności drogą transformacji genetycznej - poprzez przeniesienie obcych genów do genomu biorcy i ich stabilną integrację z nim, jest jedynie nową, o wiele bardziej specyficzną i skuteczną metodą, która eliminuje element losowości występujący w klasycznych technikach. Przenoszenie cech za pomocą klasycznych metod odbywało się nie tylko w obrębie gatunku, ale także między gatunkami i rodzajami, choć były to zbliżone pule genów. Natomiast gen wprowadzony drogą transformacji genetycznej może pochodzić od organizmu spokrewnionego (innej rośliny) lub pochodzącego nawet z odległej jednostki systematycznej - bakterii, wirusów lub zwierząt.

  • fig000.jpeg Rysunek 1. Okładka "Food Processing", Marzec 2000 (www.soybean.com).

2. Jakie rośliny transformowano genetycznie?

Pierwsze rośliny transgeniczne uzyskano w 1983 roku - były to tytoń i petunia. Obecnie transformacji genetycznej poddano wiele gatunków roślin użytkowych: zbóż (pszenica, jęczmień, ryż), roślin oleistych (rzepak, słonecznik), motylkowych (soja, groch, lucerna), warzyw (ziemniak, brokuł, kalafior, kapusta, marchew, ogórek, papryka, pomidor, sałata, seler, szparagi, rzodkiewka), owoców (banan, grusza, jabłoń, kiwi, malina, morela, śliwa, truskawka, winorośl) oraz innych o dużym znaczeniu gospodarczym, takich jak bawełna, len, burak cukrowy. Transgeny wprowadzono także do roślin ozdobnych (chryzantema, goździk, lilia, petunia, róża, tulipan) oraz roślin modelowych ( Arabidopsis , Tradescantia ) celem prowadzenia badań naukowych nad mechanizmami tego procesu.

3. Otrzymywanie roślin transgenicznych.

Pierwszym etapem uzyskania rośliny transgenicznej jest wybór określonego genu do transformacji, czyli odpowiedź na pytanie, jaką pożądaną cechę chcemy nadać roślinie oraz przez jaki gen jest ona kodowana. Należy zauważyć, że nie jest to łatwe, gdyż wymaga poznania ekspresji i regulacji genu oraz jego oddziaływań z innymi genami. Następnie należy wybrany gen wyizolować i sklonować do wektora. Kolejnym etapem jest wybór metody wprowadzenia genu do komórek roślinnych oraz wybór tkanek roślinnych przeznaczonych do transformacji, co pociąga za sobą opracowanie metodyki regeneracji transformowanych komórek celem uzyskania kompletnie wykształconych roślin. Ostatni etap, to sprawdzenie integracji i ekspresji wprowadzonego genu, a także zbadanie jego stabilności i sposobu dziedziczenia w kolejnych pokoleniach.

Transgen wymaga odpowiedniego przygotowania, zanim zostanie wprowadzony do rośliny, czyli stworzenia konstruktu genowego, który będzie zawierał:

Sekwencje regulacyjne niezbędne do funkcjonowania genu, czyli promotor (konieczny do inicjacji transkrypcji) i terminator (odpowiedzialny za jej ukończenie). Najbardziej pożądaną cechą promotora jest wysoki poziom ekspresji, co zapewni wysoki poziom transkrypcji wybranemu genowi. Najczęściej używany jest silny, roślinnie specyficzny promotor wirusa mozaiki kalafiora (CaMV 35 S). Ponadto poszukiwane są promotory tkankowo specyficzne (promotor gluteniny ulegający ekspresji w endospermie), organowo specyficzne (promotor patatyny ulegający ekspresji w bulwach) lub działające w określonych fazach rozwojowych roślin ( apg z Arabidopsis aktywizujący geny w stadium mikrospor). Terminator (np. sekwencja terminatorowa syntazy nopaliny) jest odpowiedzialny nie tylko za ukończenie transkrypcji, ale także za poliadenylację otrzymanego mRNA (ochrona przed degradacją).

Gen markerowy pozwalający wyselekcjonować transformowane komórki. Najczęściej stosowane geny markerowe to geny odporności na antybiotyki (głównie kanamycyna, a także neomycyna, chloramfenikol, hygromycyna) lub herbicydy (fosfinotrycyny, glifosat). Komórki posiadające te geny przeżyją na pożywkach selekcyjnych, zawierajęcych dany antybiotyk lub herbicyd, ponieważ wytworzą enzymy inaktywujące cytotoksyczną substancję.

Gen reporterowy umożliwiający wczesne wykrycie transformowanych komórek, którego ekspresja jest wykrywana histochemicznie, spektrofotometrycznie lub fluorymetrycznie i świadczy o funkcjonowaniu wprowadzonych genów w genomie rośliny. Jako gen reporterowy najczęściej stosuje się beta-glukuronidazę (GUS) z E.coli , ale także lucyferazę z Photinus pyralis czy CAT-acetylotransferazę chloramfenikolu.

  • fig001.jpeg

    Rysunek 3. Siewka transgenicznej Arabidopsis

Transformacja odbywa się w warunkach kultur in vitro . DNA wprowadzane jest do pojedynczych komórek pozbawionych ścian komórkowych (protoplastów) lub tkanek czy organów, z których łatwo jest zregenerować rośliny: zarodków somatycznych i zygotycznych, stożków wzrostu, liścieni, hipokotyli siewek, fragmentów liści, międzywęźli, ogonków liściowych i kwiatowych, tkanki kalusowej, mikrospor czy niedojrzałego pyłku.

W momencie otrzymania rośliny transgenicznej wymagane jest sprawdzenie metodami molekularnymi obecności wprowadzonego DNA: metodą PCR (wykrycie nawet śladowych ilości danego DNA), Southern Blot (wykrycie danego DNA za pomocą sondy oligonukleotydowej) lub Northern Blot (wykrycie transkrypcji danego genu poprzez wykrycie mRNA za pomocą sondy oligonukleotydowej).

Geny wprowadzane do roślin charakteryzują się różnym stopniem ekspresji i segregacji, niektóre kopie genów pozostają milczące. Wynika to z faktu, iż wprowadza się wiele kopii genu, które mogą się wbudować w różne miejsca na chromosomach. Transformanty z włączoną tylko jedną kopią genu charakteryzują się większą stabilnością. Wpływ na stabilność genu mają także warunki środowiskowe, w jakich rośliny rosną. Aby otrzymać odmianę transgeniczną należy wytworzyć i przebadać minimum 200 linii roślin zawierających dany konstrukt genowy.

4. Metody transformacji.

4.1. Metody wektorowe:

  • fig002.jpeg

    Rysunek 3. Tumor wywołany przez Agrobacterium tumefaciens

Niektóre bakterie glebowe z rodzaju Rhizobium wykazują zdolność do przenoszenia swojego DNA do komórek roślin. To rewolucyjne odkrycie stało się podstawą do opracowania metody transformowania komórek roślinnych za pomocą plazmidów występujących w komórkach bakterii Agrobacterium tumefaciens'Agrobacterium rhizogenes . Plazmid Ti (tumor inducing) z Agrobacterium tumefaciens powoduje powstawanie tumorowatych narośli, natomiast plazmid Ri (roots inducing) z Agrobacterium rhizogenes powoduje wytwarzanie dużej ilości drobnych korzeni. Na plazmidach Ti i Ri znajdują się geny powodujące infekcję komórek roślinnych oraz zmianę ich metabolizmu, co powoduje zmiany fenotypowe. Najważniejszy fragment plazmidu stanowi odcinek T - DNA (długość 23 tysiące par zasad), który po zakażaniu rośliny ulega integracji z genomem rośliny. Zawiera on geny syntezy opin - związków chemicznych będących źródłem węgla i azotu dla bakterii żyjących w przestrzeniach międzykomórkowych rośliny, a także geny odpowiedzialne za biosyntezę regulatorów wzrostu roślin: cytokinin i auksyn. Stymulują one podziały stransformowanych komórek, co umożliwia powstanie tumoru. Na końcach T - DNA znajdują sie krótkie sekwencje ( o długości 24 - 25 par zasad), które są konieczne do integracji fragmentu T do genomu gospodarza. W proces przeniesienia T - DNA zaangażowane są też inne geny zlokalizowane zarówno na plazmidzie Ti , jak i na chromosomie bakteryjnym, które są odpowiedzialne za katabolizm opin, koniugacyjny transfer plazmidu, jego replikację, wirulencję bakterii i zasięg zainfekowanych roślin. Proces infekowania roślin przez Agrobacterium'Ti po usunięciu onkogenów z fragmentu T - DNA można wykorzystać jako wektor do wprowadzania transgenów do roślin. Do wprowadzenia T - DNA niezbędne są sekwencje graniczne, posiadające miejsca rozpoznawane przez enzymy wycinające ten fragment. Pomiędzy nimi można umieścić przygotowany konstrukt. W ten sposób uzyskuje się szczepy bakterii (wyprowadzone z dzikich superwirulentnych szczepów), zdolne do przeniesienia danego DNA do rośliny i zintegrowania go z genomem. Obecnie do transformacji roślin używa się wektorów pochodnych od Ti . Dodatkowo można wspomagać transformację poprzez ranienie tkanki roślinnej bądź dodanie do pożywki octanu syryngonu, aktywującego geny wirulencji bakterii. Niestety kontakt z bakteriami i antybiotykami działa ujemnie na zdolności regeneracyjne niektórych gatunków roślin. Metoda wektorowa przy użyciu Agrobacterium jest najczęściej stosowaną, najstarszą metodą transformacji komórek roślinnych. Posiada ona jednak wadę - może być używana jedynie dla roślin dwuliściennych, gdyż rośliny jednoliścienne (w tym zboża) są odporne na infekcje Agrobacterium . W ostatnich latach udało się jednak przy użyciu tej metody dokonać transformacji ryżu i lilii.

  • fig003.jpeg

    Rysunek 4. Transformacja roślin przy pomocy Agrobacterium tumefaciens (www.boneslab.chembio.ntnu.no/Tore).

4.2. Metody bezwektorowe:

Makroiniekcja - polega na wstrzykiwaniu wodnego roztworu plazmidu (zawierającego konstrukt) w rozwijający się kwiatostan roślin w stadium przedmejotycznym. Wprowadzony gen znajduje się w nasionach wytworzonych przez te rośliny.

Mikroiniekcja - polega na bezpośrednim wprowadzeniu DNA do jąder protoplastów, daje około 15 - 25 % transformantów, jest to jednak metoda bardzo pracochłonna.

Elektroporacja - polega na wprowadzeniu DNA do protoplastów za pomocą krótkich impulsów elektrycznych, które powodują powstawanie porów w błonie protoplastu, przez które DNA (w formie linearnej) wnika do wnętrza komórki. Wydajność metody wynosi 2 - 8 %. Jej ograniczeniem jest możliwość stosowania jedynie dla roślin, z opracowaną metodą regeneracji protoplastów.

Metoda chemiczna - polega na inkubacji protoplastów z plazmidowym DNA w obecności jonów magnezu i glikolu polietylenowego (PEG), który obniża napięcie powierzchniowe błony komórkowej, umożliwiając wnikniecie konstruktu genowego (DNA w formie linearnej) wraz z DNA nośnikowym, pochodącym z grasicy cieląt. Wydajność metody wynosi 0,1 - 12 %.

Mikrowstrzeliwanie - polega na wstrzeliwaniu do komórek roślinnych cząstek metali (wolframu lub złota o średnicy 0,5 - 5 mikrometrów) opłaszczonych DNA, za pomocą tzw. particle gun'Agrobacterium

5. Wykorzystanie roślin transgenicznych.

Metody transformacji genetycznej roślin mogą być wykorzystane do rozwiązania wielu problemów współczesnego rolnictwa i nie tylko.

Odporność roślin na herbicydy.

Obecnie do zwalczania chwastów używa się herbicydów selekcyjnych, co oznacza, że roślina uprawna jest na nie odporna, natomiast chwasty - nie. Nie podlegają one jednak biodegradacji, są wiec szkodliwe dla środowiska. Natomiast herbicydy, które mogą ulegać szybkiemu rozkładowi w środowisku, są nie selektywne. Modyfikacja genetyczna roślin uprawnych poprzez wprowadzenie kopii genu odporności na substancję czynną herbicydu umożliwia stosowanie takich nie selektywnych herbicydów do zwalczania chwastów.

Odporność roślin na choroby i szkodniki.

Otrzymanie roślin odpornych na choroby (wirusowe, grzybowe, bakteryjne) i szkodniki może zaspokoić potrzeby żywieniowe ludzkości, gdyż zmniejsza straty upraw. Umożliwia ponadto zmniejszenie zużycia środków ochrony roślin, które są kosztowne i nieprzyjazne dla środowiska. Brak metod bezpośredniego zwalczania wirusów roślinnych środkami chemicznymi, może być rekompensowany przez tworzenie roślin transgenicznych zawierających geny oporności na wirusy (są to geny kapsydu wirusa, wirusowej proteazy bądź wirusowej replikazy). Odporność na choroby grzybowe można uzyskać wprowadzając transgeny odpowiedzialne za syntezę chitynaz lub beta-1,3-glukanaz, które rozkładają ściany komórkowe grzybów. Istnieją także geny oporności roślin (R) na patogeny, których źródłem są prymitywne lub dziko rosnące formy pokrewne. Są one przenoszone poprzez długotrwałe i żmudne procesy krzyżowania ze sobą roślin, natomiast transformacja genetyczna umożliwa wprowadzenie tych genów w stosunkowo krótkim czasie. Odporność na szkodniki można uzyskać przez wprowadzenie genów inhibitorów enzymów trawiennych owadów (inhibitor proteazy II z pomidora) lub genów Bt z Bacilllus thuringiensis . Geny Bt'Cry , które w przewodzie pokarmowym owadów żerujących na roślinie transgenicznej ulegają częściowemu rozkładowi tworząc toksyny. Warto zauważyć, iż toksyny Cry'Lepidoptera , Coleoptera i Diptera . Pozwoliło to na otrzymanie ziemniaków niewrażliwych na stonkę ziemniaczaną. Należy jednak nadmienić, że bardzo często typ szkodnika zależy od regionu, co oznacza konieczność dostosowania modyfikacji genetycznych do warunków lokalnych.

Zwiększenie produkcji ziaren przez zboża.

Wprowadzenie genu NORIN 10 do zboża powoduje skrócenie i wzmocnienie łodyg roślin czyniąc je bardziej odpornymi na urazy mechaniczne. Ponieważ wzrost elongacyjny komórek części wegetatywnych roślin ulega zahamowaniu, możliwy jest lepszy rozwój części generatywnych roślin, czyli produkcja nasion.

Tolerancja roślin na stres abiotyczny.

Wiele obszarów Ziemi zostało wyłączonych z uprawy ze względu na wysokie zasolenie lub silnie zasadowy odczyn gleby. Gen tolerancji na wysokie zasolenie pochodzący z mangrowców ( Avicennia marina ) umożliwia stworzenie roślin transgenicznych znoszących duże zasolenie, co daje nadzieję na wykorzystanie części nieużytków. Wyprodukowano także transgeniczne rośliny z nadprodukcją kwasu cytrynowego w korzeniach, które wykazują większą tolerancję na glin w glebie, a także mrozoodporną transgeniczną truskawkę.

Podniesienie zawartości odżywczych i smakowych roślin.

Wprowadzenie genów kodujących określone białka może wyeliminować niektóre choroby związane z niedoborem mikroelementów lub witamin. Stworzono np. transgeniczny ryż (wykorzystując geny żonkila), który wykazuje zwiększoną produkcję beta-karotenu, prekursora witaminy A, co powoduje żółte zabarwienie nasion. Trwają prace nad uzyskaniem ryżu o 2 - 4 krotnie zwiększonym stężeniu żelaza (dzięki genom kodującym białka odpowiedzialne za wiąznie tego pierwiastka). Dzięki modyfikacji genetycznej można ponadto uzyskać żywność o lepszych walorach smakowych czy zapachowych np. kawę o obniżonej zawartości kofeiny i lepszym aromacie.

Polepszenie innych właściwości użytkowych roślin.

Modyfikacja procesów fizjologicznych związanych z dojrzewaniem owoców może przedłużyć ich trwałość oraz ułatwić składowanie. Zmodyfikowanie genetyczne pomidora poprzez wprowadzenie genu kodującego PG (poligalakuronazę), enzymu odpowiedzialnego za rozkład pektyn w ścianach komórkowych (pośrednio odpowiedzialnego za mięknięcie owoców) w pozycji antysensownej spowodowało jego inaktywację i przedłużyło znacznie trwałość pomidora. W transgenicznych pomidorach po transkrypcji powstało sensowne i antysensowne mRNA, które jako komplementarne hybrydyzowało ze sobą, uniemożliwiając syntezę białka.

  • fig004.jpeg Rysunek 5. Transgeniczne pomidory. (www.foeeurope.org/GMOs)

Powiększenie spektrum barw roślin ozdobnych.

Poprzez modyfikacje drogi powstawania barwników roślinnych można uzyskać nowe spektrum barw kwiatów. Przykładowo wprowadzenie do petunii genu dihydroflawonolu z kukurydzy znacznie poszerzyło paletę barw tych kwiatów. Wiele nowych barw pospolitych w naszych domach fiołków afrykanskich uzyskano dzięki transformacji genetycznej.

Bioreaktory.

Transgeniczne rośliny można także wykorzystać jako bioreaktory - do produkcji antybiotyków, enzymów czy hormonów (np. tytoń produkujący somatotropinę). Naukowcy pracują nad pomidorami i sałatą, które produkowałyby szczepionki. Jako inny przykład może posłużyć transgeniczna lucerna, która poprzez wprowadzenie genu z Bacillus licheniformis produkuje alfa-amylazę. Roślina zużywa energię słoneczną, ma zdolność wiązania azotu (lucerna jest rośliną motylkową) i daje wysoki plon białka, co czyni produkcję nawet tańszą niż przy użyciu mikroorganizmów. Natomiast naukowcy z firmy Monsanto opracowali transgeniczne rzeżuchę i rzepak produkujące plastik, ulegający biodegradacji!

6. Zagrożenia.

Rośliny transgeniczne wywołują wiele obaw o bezpieczeństwo ludzi i środowiska. Raz wprowadzone do środowiska są praktycznie niemożliwe do usunięcia z niego, przez co są określane przez GREENPEACE jako "genetic pollution" - "genetyczne zanieczyszczenie". Istnieją obawy, że transgeniczne rośliny będą krzyżowały się ze swoimi dzikimi krewniakami, co spowoduje spadek bioróżnorodności. Należy jednak zauważyć, że obecne monokultury także przyczyniają się do zubożenia puli genów. Przenoszenie pyłku na sąsiednie pola nie ma miejsca w przypadku uprawy transgenicznych buraków, gdyż są one zbierane przed kwitnieniem czy ziemniaków, które rozmnażają się wegetatywnie. Jest ono ograniczone także w przypadku, gdy rośliny spokrewnione nie występują w środowisku (np. bawełna w USA). Natomiast transfer genów w przypadku rzepaku czy żyta jest znacznie bardziej prawdopodobny, co wiąże się z niebezpieczeństwem powstania super - chwastów bardzo trudnych do zwalczania. Niemieccy naukowcy proponują rozwiązanie tego problemu przez wprowadzenie transgenu nie do DNA jądrowego, lecz do DNA plastydowego (chloroplastów), co uniemożliwi transfer genów za pomocą pyłku. Plastydy, tak jak mitochondria, pochodzą z komórki jajowej. Problemem natury ekonomicznej jest też fakt, iż w przypadku upraw roślin transgenicznych, nie można zachować nasion do wysiania w następnym roku, tylko trzeba co roku sprowadzać je z firm nasiennych. Rośliny transgeniczne budzą także inne obawy, że transgeny mogą stać się źródłem alergenów i toksyn. Należy jednak zauważyć, że ryzyko wystąpienia alergii jest niewielkie, ze względu na fakt, iż rośliny transgeniczne są bardzo dokładnie badane pod tym kątem zanim trafią na rynek. Obawy budzi także użycie genów oporności na antybiotyki jako markerów selekcyjnych. Rozprzestrzenienie tych genów w organizmach roślinnych może spowodować oporność na antybiotyki wśród patogenów, np. na nadal stosowaną w leczeniu wielu chorób człowieka kanamycynę. Dlatego też poszukuje się innych markerów - np. system selekcji PMI, oparty na genie kodującym izomerazę mannozo-6-fosforanu. Należy jednak zwrócić uwage, że przyczyną oporności szczepów na antybiotyki może być ich nierozważne stosowanie w leczeniu chorób, gdyż powoduje to powstanie naturalnej presji selekcyjnej.

7. Przyszłość.

Możliwe, że to właśnie rośliny transgeniczne skolonizują Marsa. Naukowcy Ferl z Uniwersytetu Stanu Floryda pracują nad genetycznie zmienioną gorczycą, która ma polecieć na Marsa około 2007 roku, by zasiedlić szklarnie zbudowane przez robota na Czerwonej Planecie. Do gorczycy ma być wprowadzony transgen, składający się z genu, odpowiedzialnego za odczuwanie stresu z Arabidopsis thaliana'GFP - białko świecące na zielono z Aequorea victoria . Transgeniczna gorczyca świecąc sygnalizuje warunki stresowe: niski poziom tlenu, brak wody, suszę, ekstremalne zmiany temperatur czy nieodpowiedni skład substancji w glebie.

Przyszłość roślin transgenicznych zależy jednak od rzetelnej kampanii informacyjnej, która pozwoli przełamać lęk oraz zdobyć akceptację społeczeństwa. Wydaje się jednak, iż postęp, jaki dokonał się w tej dziedzinie jest już nie do zahamowania i uprawy roślin transgenicznych niedługo pojawią się za naszymi oknami, stanowiąc przykład rolnictwa XXI wieku.

  • fig005.jpeg Rysunek 6. Wizja przyszłości.

8. Odnośniki.

  1. "Zastosowanie metod biotechnologicznych w hodowli roślin", Praca zbiorowa pod redakcją Barbary Michalik Wydawnictwo DRUKOL s.c.,Kraków 1996

  2. http://newssearch.bbc

  3. Transgenetic Plants and Organic Farming
  4. Transgenetic Plants and World Agriculture
  5. http://eduseek.interklasa.pl/edukurier

  6. http://tygodnik.onet.pl

  7. GREENPEACE
  8. The NTNU Plant Genetics Group
  9. Portal farmaceutyczno-medyczny


Kategorie: Inne

Articles: Sojka03 (last edited 2011-02-15 23:03:53 by localhost)