Articles wiki

Wstęp

Przeciwciała syntetyzowane in vivo cechują się ogromną heterogennością, są to przeciwciała należące do różnych klas, wykazują odmienne powinowactwo do antygenu, nazywane są więc poliklonalnymi. Ta odmienność jest wynikiem równoczesnego pobudzenia w obecności antygenu pewnego procentu limfocytów B, które zaczynają się dzielić, przy czym każdy z aktywowanych limfocytów tworzy osobny klon, produkujący określone przeciwciało. Jedynie immunoglobuliny wytwarzane przez klony nowotworowe u ludzi i myszy są pod każdym względem homogenne. Ponadto, klon nowotworowy oprócz wytwarzania identycznych immunoglobulin czyli monoklonalnych jest nieśmiertelny i można go w nieskończoność pasażować (czyli przenosić do kolejnych naczyń hodowlanych). Techniki wytwarzania przeciwciał monoklonalnych zrewolucjonizowały wiele dziedzin nauki. Są one wykorzystywane między innymi do wykrywania i określania stężenia leków, hormonów, enzymów (nawet jeśli występują w bardzo niewielkich ilościach), diagnostyce chorób zakaźnych, diagnostyce nowotworów a także w nowoczesnych metodach terapii antynowotworowych.

Sposoby produkcji przeciwciał monoklonalnych

Klasycznym sposobem otrzymywania przeciwciał monoklonalnych jest zastosowanie fuzji komórki nowotworowej szpiczaka (nowotworu wywodzącego się z szeregu rozwojowego limfocytów B ) z limfocytem B pochodzenia śledzionowego myszy, po wcześniejszej jej immunizacji stosownym antygenem. Fuzji dokonuje się w obecności glikolu etylenowego, a następnie poddaje selekcji w pożywce. Zwykle stosuje się komórki szpiczaka niezdolne do wzrostu w nieobecności określonego czynnika w pożywce, który to czynnik może zostać dostarczony komórce nowotworowej przez limfocyt B po zajściu fuzji. Pożywka selekcyjna jest więc tak dobrana, aby nie zawierała potrzebnego komórkom szpiczaka czynnika. Dzięki temu można wyselekcjonować z jej pomocą hybrydy, gdyż komórki szpiczaka nie będą zdolne do wzrostu w takich warunkach, podobnie jak limfocyty B, które utrzymywane są przy życiu przez cytokiny, których również nie zawiera się w pożywce. Ostatecznie dokonuje się selekcji tych hybryd, które produkują interesujące nas przeciwciało, swoiste w stosunku do danego antygenu. Tak uzyskane hybrydy wykazują cechę nieśmiertelności i produkcji ściśle swoistego przeciwciała. Są więc, ujmując to bardziej obrazowo, fabrykami służącymi produkcji przeciwciał o określonej swoistości.

Wykorzystanie przeciwciał uzyskiwanych powyższym sposobem w celach leczniczych wiąże się z dużymi ograniczeniami. Mianowicie, uzyskiwane są w ten sposób przeciwciała mysie mają zdolność indukcji odpowiedzi immunologicznej u człowieka, przez co wykazują małą skuteczność (ulegają zniszczeniu przez układ immunologiczny pacjenta) oraz mogą wywoływać stan szoku anafilaktycznego, który może prowadzić do śmierci. Utworzenie analogicznych hybryd ludzkich napotyka znaczące trudności: hybrydy takie wykazują niewielką stabilność, uzyskiwanie odpowiednich limfocytów B może być trudne, gdyż ze względów etycznych człowieka nie uczula się w celu pozyskiwania limfocytów oraz brak jest odpowiednich ludzkich linii szpiczakowych. Dlatego też obecnie uzyskuje się przeciwciała monoklonalne do celów terapeutycznych na drodze inżynierii genetycznej. Tworzy się konstrukty genowe, w których części zmienne łańcuchów, odpowiadające za wiązanie antygenu, pochodzą od myszy, natomiast części stałe, stanowiące większość cząsteczki, mają pochodzenie ludzkie. Takie geny można wprowadzać do linii komórek ssaków, a nawet komórek bakterii E.coli, które produkują wówczas tak zwane przeciwciała chimeryczne. Możliwa jest jeszcze większa redukcja regionu mysiego. Możliwa jest bowiem synteza przeciwciał humanizowanych, w których tylko niewielkie regiony w obrębie łańcuchów zmiennych tak zwane regiony hiperzmienne mają mysie pochodzenie, natomiast pozostała część cząsteczki jest pochodzenia ludzkiego. Ponadto, możliwe jest również wykorzystanie roślin i zwierząt transgenicznych, produkujących przeciwciała monoklonalne o określonej swoistości.

Przeciwciała monoklonalne w walce z nowotworami

Przeciwciała monoklonalne stanowią doskonały punkt wyjściowy do projektowania leków antynowotworowych. Ze względu na rosnącą ilość prób klinicznych, wykorzystujących przeciwciała monoklonalne w terapii, ustalono międzynarodowe nazewnictwo leków opartych na tych immunoglobulinach. Wszystkie tego typu farmaceutyki mają nazwę z końcówką mab. Leki bazujące na przeciwciałach mysich kończą się na omab (np. edrecolomab), dla przeciwciał chimerycznych obowiązuje końcówka ximab (np. infliximab), dla przeciwciał humanizowanych zarezerwowana jest końcówka zumab (np. bewacyzumab), natomiast w przypadku przeciwciał w całości ludzkich wykorzystywana jest końcówka umab (np. adalimumab).

„Nagie” przeciwciała monoklonalne

Wykorzystanie samych, nie skoniugowanych z innymi cząsteczkami przeciwciał monoklonalnych w terapii antynowotworowej może opierać się na dwóch podejściach. Po pierwsze, mogą one specyficznie rozpoznawać pewne charakterystyczne dla komórek nowotworowych antygeny na ich powierzchni, opłaszczać takie komórki i stanowić swoisty znacznik, nakierowujący na tak oznaczony cel różnorodne mechanizmy odpowiedzi immunologicznej. W efekcie dochodzi do bardziej efektywnego rozpoznania komórki nowotworowej. Komórki po transformacji nowotworowej wykształcają bowiem zwykle specyficzne mechanizmy utrudniające ich rozpoznawanie i niszczenie przez układ odpornościowy. Podanie przeciwciał monoklonalnych zwiększa znacząco prawdopodobieństwo ich namierzenia, co stanowi pierwszy punkt prowadzący do ich zniszczenia. Przykładami leków należących do grupy nagich przeciwciał monoklonalnych, działających zgodnie z tym mechanizmem należą:

• Rituximab (Rituxan): jest to lek wykorzystany do leczenia m.in. chłoniaka złosliwego i oparty na rozpoznaniu cząsteczki CD20 obecnej na limfocytach B, z których wywodzi się ten nowotwór (cząsteczki CD20 są nieobecne na komórkach macierzystych szpiku i komórkach progenitorowych, więc zastosowanie przeciwciał skierowanych na CD20 nie wpływa znacząco na proces hematopoezy)
• Alemtuzumab (Campath): farmaceutyk rozpoznający cząsteczkę CD52 obecną na limfocytach T i B i wykorzystywany w terapii przewlekłej białaczki limfocytowej B.

Drugim podejściem jest wykorzystanie przeciwciał monoklonalnych, łączących się z takimi cząsteczkami na powierzchni komórek nowotworowych, które są istotne dla ich funkcjonowania. Związanie przeciwciała do tychże cząsteczek blokuje ich aktywność i tym samym zaburza funkcje komórki nowotworowej. Przykładami leków z tej kategorii są:

• Trastuzumab (Herceptin): lek ten stanowi przeciwciało skierowane przeciwko białku HER2/neu, które obecnie jest w dużych ilościach między innymi na powierzchni komórek raka piersi. Białko to jest konieczne do wzrostu tych komórek i poprzez jego blokowanie możliwe jest leczenie nowotworu piersi
• Cetuximab (Erbitux): jest to przeciwciało łączące się z białkiem EGFR, występującym obficie na powierzchni różnych komórek nowotworowych i jest konieczne dla ich wzrostu i podziałów. Lek ten wykorzystuje się w terapii nowotworów przewodu pokarmowego, głowy i szyi
• Bevacizumab (Avastin): lek ten skierowany jest przeciwko śródłonkowemu czynnikowi wzrostu VEGF. Czynnik ten konieczny jest w procesie angiogenezy (tworzenia nowych naczyń krwionośnych), dzięki któremu guz może ulec unaczynieniu i efektywnie się rozwijać. Poprzez blokowanie VEGF odcina się guz od dopływu substancji odżywczych z krwi, co hamuje jego rozwój. Do tej pory farmaceutyk ten znalazł zastosowanie w leczeniu nowotworów przewodu pokarmowego, płuc, piersi, ale ciągle trwają próby wykorzystania tego leku w leczeniu innych nowotworów.

Zastosowanie przeciwciał monoklonalnych we wspomniany wyżej sposób wiąże się z możliwością wystąpienia skutków ubocznych. Jednym z najpoważniejszych powikłań jest ich interakcja z prawidłowymi komórkami i blokowanie fizjologicznych procesów. Przykładowo, mogą one wpływać na komórki szpiku, zmniejszając liczbę komórek krwi, przez co pacjenci stają się bardziej podatni na krwotoki i infekcje.

Immunotoksyny

Immunotoksyny są, jak sama nazwa wskazuje, kompleksami przeciwciał z toksynami, połączonymi chemicznie. Możliwe jest wykorzystanie toksyn roślinnych: rycyna (z rącznika), abryna (z modligroszku właściwego), bakteryjnych: defterotoksyna (toksyna błonicy), egzotoksyna A Pseudomonas oraz grzybowych: α – amanityna (z muchomora sromotnikowego), α – sarcyna (z gatunku kropidlaka Aspergillus giganteus). Spośród wymienionych przykładów rycyna i dyfterotoksyna wykazują największą skuteczność w zabijaniu komórek: już pojedyncza cząsteczka toksyny ma zdolność uśmiercenia komórki. Idea wykorzystania immunotoksyn w walce z nowotworami jest prosta: przeciwciało skierowane przeciw strukturom na powierzchni komórki nowotworowej ma za zadanie doprowadzić do komórki rakowej toksynę, która ma tę komórkę zniszczyć. Spodziewano się osiągnięcia spektakularnych wyników za sprawą takich koniugatów, określano je nawet mianem magicznej kuli. Jednakże, jak okazało się w praktyce, immunotoksyny wykazują dość znaczną niepożądaną toksyczność w stosunku do komórek prawidłowych, np. komórek wątroby przez którą takie kompleksy są wychwytywane. Ponadto, dużą wadą jest silna immunogoenność komponenty toksynowej i wytwarzanie przeciw niej immunoglobulin w ustroju. Obecnie w powszechnym użyciu w terapii antynowotworowej jest tylko jedna immunotoksyna, znana pod nazwą gemtuzumab ozogamicin (Mylotarg). Lek ten zawiera toksynę promieniowców kalicheamycynę oraz przeciwciało skierowane przeciwko antygenowi CD33, który obecny jest na wielu komórkach białaczkowych i wykorzystywany jest w leczeniu ostrej białaczki szpikowej.

Koniugaty przeciwciał monoklonalnych z radioizotopami

Możliwe jest połączenia przeciwciał monoklonalnych z izotopami emitującymi promieniowanie, za pomocą którego komórki nowotworowe są efektywnie niszczone. Tego typu koniugaty wykazują podwójne działanie. Po pierwsze dochodzi do blokowania ważnych cząsteczek na powierzchni komórki nowotworowej za sprawą przeciwciała, co zaburza wzrost i podziały. Po drugie, emitowane przez radioizotop promieniowanie prowadzi do zniszczenia komórki. Ponadto, ze względu na fakt, iż promieniowanie wykazuje określony zasięg, możliwe jest niszczenie komórek niezwiązanych bezpośrednio z przeciwciałem, na przykład komórek nowotworowych we wnętrzu zwartego guza. Takiego działania same przeciwciała nie wykazują, przez co komórki warstw głębszych zwykle są oporne na terapię nagimi przeciwciałami. Obecnie w terapii wykorzystuje się farmaceutyki oparte na przeciwciałach monoklonalnych skierowanych przeciwko cząsteczce CD20 skoniugowane z Y-90 (ibritumomab tiuxetan) i I-131 (tositumomab). W pierwszym przypadku emitowane jest promieniowanie β, o zasięgu 1 – 5 nm, natomiast w drugim przypadku dochodzi do emisji promieniowania γ, które penetruje tkanki już na znacznej głębokości, wykazuje duży zasięg, co ogranicza jego stosowalność, ze względu na efekty uboczne w postaci niszczenia zdrowych tkanek. Te koniugaty przeciwciał monoklonalnych znalazły zastosowanie w terapii chłoniaka złośliwego, podobnie jak wcześniej wspomniany rituximab.

Przeciwciała monoklonalne o podwójnej swoistości

Są to przeciwciała uzyskiwane często na drodze chemicznego sprzęgania dwóch różnych przeciwciał, przez co uzyskuje się cząsteczkę zawierającą cztery miejsca wiążące antygen (cztery fragmenty Fab), a każda z par fragmentów Fab wiąże inną cząstkę. Tego typu przeciwciała można także uzyskać na drodze fuzji dwóch hybryd, produkujących przeciwciała o różnej swoistości. W efekcie takiej fuzji tworzy się tzw. kwadromy, z których niewielki odsetek syntetyzuje przeciwciała o podwójnej swoistości. Celem zastosowania takich przeciwciał jest bardziej efektywna stymulacja układu odpornościowego gospodarza do niszczenia komórek nowotworowych. Mianowicie, można podawać pacjentom przeciwciała łączące się ze specyficznymi cząsteczkami na powierzchni komórek rakowych i równocześnie z cząsteczkami na powierzchni komórek układu odpornościowego, przez co następuje ściąganie tych komórek w obszar występowania nowotworu oraz ich aktywacja. Przykładowo, można podawać dwa różne przeciwciała o podwójnej swoistości takie, iż oba rozpoznają antygeny nowotworowe, jedno z nich łączy się dodatkowo z cząsteczką CD3 obecną na limfocytach T, a drugie z cząsteczką CD28, również charakterystyczną dla limfocytów T. Obie te cząsteczki, CD3 i CD28 są bardzo istotne w procesie aktywacji limfocytów T. Cząsteczka CD3 umożliwia rozpoznawanie antygenów przez receptory TCR, natomiast cząsteczka CD28 dostarcza tak zwanego drugiego sygnału, niezbędnego do pełnej aktywacji. W wyniku pełnej aktywacji limfocytów T dochodzi do silniejszej mobilizacji układu odpornościowego poprzez aktywację limfocytów B przy udziale pomocniczych limfocytów T, produkcję cytokin i przyciąganie w pobliże guza innych komórek układu immunologicznego. Podobnie można aktywować za sprawą przeciwciał o podwójnej swoistości także inne komórki jak makrofagi, neutrofile, komórki NK. Aby zwiększyć wydajność terapii z wykorzystaniem przeciwciał o podwójnej swoistości często wraz z przeciwciałami podaje się komórki efektorowe aktywowane przez to przeciwciało.

Koniugaty przeciwciał monoklonalnych z lekami

Takie koniugaty mają na celu dostarczenie leku przeciwnowotworowego bezpośrednio w miejsce występowania guza. Wykorzystuje się tu swoistość przeciwciał skierowanych przeciw antygenom komórek rakowych i można je traktować jako wyjątkowo swoiste nośniki dla leku. Zaletą takich koniugatów jest ich ograniczona immunogenność, dzięki czemu bardziej wydajnie docierają do miejsca przeznaczenia. Dużym problemem w tym przypadku jest jednak konieczność związania leku z przeciwciałem w taki sposób, aby ten pierwszy ulegał depozycji po dotarciu do guza, nie natomiast w krążeniu, co powodowałoby destrukcję tkanek prawidłowych. Stosowane leki przeciwnowotworowe, takie jak doksorubicyna, wykazują bowiem toksyczny efekt w stosunku do wszystkich komórek. Przykładem koniugatu przeciwciało – lek, który znalazł zastosowanie w terapii białaczki szpikowej jest farmaceutyk gemtuzumab ozogamycyna, w który to kompleksie wykorzystano przeciwciała rozpoznające cząsteczki CD33. Dodatkowo, możliwe jest też sprzęganie przeciwciał z nieaktywnym prolekiem oraz enzymem, mającym zdolność aktywowania tego proleku. Dzięki temu znacząco obniża się toksyczność takiego leku, gdyż w postaci aktywnej gromadzi się on w zasadzie tylko w obrębie komórek nowotworowych.

Koniugaty przeciwciał monoklonalnych z cytokinami

Takie koniugaty, zwane immunocytokinami, wywierają podwójne działanie antynowotworowe. Po pierwsze, immunoglobulina łączy się cząsteczkami na powierzchni komórek nowotworowych i stymuluje niszczenie takich komórek na drodze aktywacji układu dopełniacza lub cytotoksyczności zależnej od przeciwciał. W niektórych przypadkach związanie przeciwciała inaktywuje dodatkowo istotne dla komórki nowotworowej białka powierzchniowe, przez co uniemożliwia jej wzrost i dalszą proliferację. Przyłączona do przeciwciała cytokina, ma natomiast stymulować komórki układu immunologicznego do rozpoznawania i efektywnego niszczenia stransformowanych komórek. Dotychczas podjęto próby leczenia czerniaka z wykorzystaniem koniugatu przeciwciała skierowanego przeciwko gangliozydowi GD2 z interleukiną 2 oraz w przypadku raka okrężnicy, jajnika, płuc, gruczołu krokowego wykorzystano przeciwciała rozpoznające antygen Ep – CAM (epitelialną cząsteczkę adhezyjną ulegającą zwiększonej ekspresji w niektórych komórkach rakowych) i również interleukinę 2.

Pochodne przeciwciał o zmniejszonej masie cząsteczkowej

„Tradycyjne” przeciwciała monoklonalne cechują się wysoką masą cząsteczkową. Dlatego też, z bardzo niewielką wydajnością mogą penetrować wnętrze tkanek i podobnie bardzo mało efektywnie działają na komórki we wnętrzu nowotworowych guzów. Stąd też, coraz większe nadzieje na skuteczniejszą walkę z chorobami nowotworowymi dają pochodne przeciwciał monoklonalnych o zmniejszonej masie cząsteczkowej. Jednym z przykładów takich cząsteczek są jednołańcuchowe białka wiążące antygen, znane także pod nazwą scFV . Są to uzyskiwane na drodze inżynierii genetycznej cząsteczki, obejmujące część zmienną łańcucha ciężkiego VH i część zmienną łańcucha lekkiego Vl, połączone krótkim łańcuchem peptydowym. Bardziej rozbudowane są miniciała, które składają się niejako z dwóch cząsteczek scFv, z których każda przyłączona jest do domeny CH3 łańcucha ciężkiego. Mogą być one uznane za zminiaturyzowane przeciwciała monoklonalne. Możliwe jest ponadto tworzenie diciał, zbudowanych jedynie z dwóch fragmentów scFv, a nawet trójciał czy czwórciał, zawierających odpowiedni trzy i cztery fragmenty scFv w każdej cząsteczce. W przypadku miniciał, diciał, trójciał czy czwórciał możliwe jest łączenie ze sobą fragmentów scFV o różnych swoistościach, rozpoznających różne antygeny i wykorzystanie ich w terapii nowotworów do jednoczesnego rozpoznawania antygenów komórek rakowych i aktywowania komórek układu odpornościowego. Ponadto, pochodne przeciwciał monoklonalnych o zmniejszonej masie łatwiej penetrują wnętrze guzów, wykazują większa zdolność do akumulacji oraz cechują się krótszym czasem krążenia we krwi. Podobnie jak w przypadku przeciwciał monoklonalnych i te cząsteczki można łączyć z toksynami, radioizotopami, lekami generując efektywnie zwalczające komórki nowotworowe koniugaty.

Podsumowanie

Wykorzystanie przeciwciał monoklonalnych w terapii nowotworów jest z pewnością doskonałą alternatywą w stosunku do klasycznych metod walki z tą chorobą, które są wyjątkowo obciążające dla organizmu i powodują liczne skutki uboczne. Przeciwciała monoklonalne i ich różnorodne koniugaty mogą w sposób stosunkowo swoisty rozpoznawać komórki nowotworowe i prowadzić, w idealnej wersji, do ich zniszczenia na drodze: depozycji szkodliwych czynników takich jak leki przeciwnowotworowe, toksyny, promieniowanie tylko w miejscu występowania guza, mobilizacji układu odpornościowego i przyciągnięcia wyspecjalizowanych komórek w pobliże nowotworu oraz inaktywacji istotnych dla wzrostu i podziałów komórek rakowych czynników białkowych. Dzięki temu, iż istnieje bardzo wiele różnorodnych i pomysłowych rozwiązań opartych na przeciwciałach monoklonalnych możliwe jest dobieranie terapii stosownie do typu i stadium rozwojowego nowotworu. Konieczne jest jednak dalsze rozwijanie tej idei w celu ulepszania terapii, zmniejszania skutków ubocznych i zwiększania efektywności leczenia. Dlatego też, niezbędne jest prowadzenie dalszych badań i wprowadzanie kolejnych pomysłów aby móc upowszechnić terapie oparte na przeciwciałach monoklonalnych i sprawić, iż będą one powszechnie wykorzystane w walce z nowotworami.

Bibliografia

1. Jakub Gołąb, Marek Jakóbisiak, Witold Lasek, Tomasz Stokłosa; „Immunologia”; wyd. PWN 2003 oraz 2007
2. R.O. Dillman, Radioimmunotherapy of B-cell lymphoma with radiolabelled anti-CD20 monoclonal antibodies

3. http://www.cancer.org/docroot/ETO/content/ETO_1_4X_Monoclonal_Antibody_Therapy_Passive_Immunotherapy.asp

4. http://www.meds.com/immunotherapy/monoclonal_antibodies.html

5. http://www.fasebj.org/cgi/reprint/5/10/2334

6. http://www.brookscole.com/chemistry_d/templates/student_resources/0030244269_campbell/HotTopics/Immunotoxin.html

7. http://www.cancer-info.com/cancerdeath.htm

8. http://www.accessexcellence.org/RC/VL/GG/monoclonal.html

9. http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/M/Monoclonals.html

10. http://www.nature.com/nm/journal/v9/n1/full/nm0103-129.html