Articles wiki

Ale po kolei

• Prąd elektryczny to ukierunkowany ruch ładunków elektrycznych w postaci np. elektronów czy jonów. Po przyłożeniu pola elektrycznego do mieszaniny cząstek naładowanych, zaczynają one się poruszać w uporządkowany sposób i tak powstaje prąd. W elektroforezie do roztworu cząsteczek, które mogą być nośnikami prądu (do tzw. elektrolitu albo buforu do elektroforezy) przykłada się „zwykły” prąd elektryczny z gniazdka. Przewody umieszcza się w pojemniku z elektrolitem w ten sposób, że po jednej stronie kabel wprowadza elektrony (elektrony są naładowane ujemnie), a z drugiej je „odbiera” (Rysunek 1). Kabel wprowadzający elektrony nazywamy katodą i oznaczamy jako „-”, natomiast kabel odbierający to anoda, czyli „+”.

• Jeśli w roztworze, przez który przepuszczamy prąd są cząsteczki naładowane ujemnie (tak jak elektrony), będą one poruszać się tak samo jak elektrony – od katody do anody. Cząsteczki naładowane dodatnio będą wędrowały w przeciwnym kierunku – od anody do katody. Szybkość ich ruchu będzie zależała od wielu czynników, np. natężenia przyłożonego prądu, ładunku i wielkości cząsteczek oraz tego, jak lepki jest roztwór, w którym znajdują się jony.

Co to ma wspólnego z biologią molekularną?

• Biologia molekularna zajmuje się biologią na poziomie molekularnym, czyli cząsteczkowym. Główne cząsteczki występujące w organizmach to białka, kwasy nukleinowe i lipidy, czyli tłuszcze. Szczególne zainteresowanie naukowców budzą białka i kwasy nukleinowe (nie oznacza to, że lipidy są nieważne!). Kwasy nukleinowe (DNA, RNA) kodują białka, wśród białek zaś wyróżniamy m.in. enzymy i hormony, które decydują o budowie i funkcji organizmu (Rysunek 2).

• Aby zrozumieć istotę elektroforezy, przyjrzymy się teraz budowie białek i kwasów nukleinowych.

Białka

• Białka są liniowymi, ale zwiniętymi w kłębek (Rysunek 2) cząsteczkami złożonymi z mniejszych podjednostek, aminokwasów, zwanych również resztami. Jest dwadzieścia różnych aminokwasów występujących w białkach. W jednym białku może być nawet około trzydziestu tysięcy aminokwasów (jak w ludzkiej tytynie – białku mięśni)! Niektóre z aminokwasów są naładowane w warunkach fizjologicznych (tzn. takich, jakie występują w organizmie): kwas asparaginowy i kwas glutaminowy są naładowane ujemnie, a lizyna, histydyna i arginina – dodatnio (Rysunek 3).

• Wypadkowy ładunek białka to suma ładunków dodatnich i ujemnych jego reszt. Jeśli np. białko posiada jedną resztę kwasu asparaginowego, jedną histydyny i dwie argininy, to jego wypadkowy ładunek w warunkach fizjologicznych wynosi -1 + 1 + 2 = +2, jest więc dodatni. Są też białka, których ładunek wynosi zero lub jest ujemny.

Kwasy nukleinowe

• Kwasy nukleinowe, podobnie jak białka, są liniowe (Rysunek 2) i zbudowane z mniejszych podjednostek, tym razem nukleotydów. Jest generalnie kilka nukleotydów występujących w organizmach i mogą one tworzyć łańcuchy o długości dochodzącej do stu dwudziestu… miliardów nukleotydów (u rośliny – szachownicy)! W warunkach fizjologicznych nukleotydy, a więc również całe łańcuchy kwasów nukleinowych, posiadają ładunek ujemny (Rysunek 4).

• Ponieważ zarówno białka, jak i kwasy nukleinowe są obdarzone ładunkiem, będą one poruszały się w polu elektrycznym. Szybkość tego ruchu będzie zależała od wypadkowego ładunku cząsteczki i jej wielkości. Cząsteczki bardziej naładowane poruszają się szybciej, tak samo jak cząsteczki mniejsze. Im cząsteczka większa lub mniej naładowana, tym wolniej się porusza. Może się zdarzyć tak, że cząsteczka jest bardzo naładowana i duża, wtedy będzie poruszała się tak samo, jak cząsteczka słabiej naładowana, ale mniejsza. Można powiedzieć, że szybkość ruchu zależy od stosunku ładunku do wielkości cząsteczki – im większy, tym ruch jest szybszy.
• Trzeba jeszcze wspomnieć, że białka mogą wędrować zarówno do anody, jak i katody, gdyż mogą być naładowane ujemnie lub dodatnio, natomiast kwasy nukleinowe zawsze są naładowane ujemnie, więc wędrują tylko do anody.

Podział metod elektroforetycznych

• Najogólniej można podzielić elektroforezę ze względu na środowisko, w którym poruszają się jony. Wyróżniamy wtedy:
  • elektroforezę swobodną
  • elektroforezę na nośnikach
• Elektroforeza swobodna zachodzi, gdy próbkę umieszcza się w roztworze i podłącza prąd. Wówczas białka czy kwasy nukleinowe swobodnie wędrują do właściwej sobie elektrody. Jednak bardzo rzadko używa się tej techniki, bowiem próbka po wprowadzeniu do roztworu „ucieka” w różnych kierunkach zanim przyłoży się prąd. Wskutek tego rozmycia nie można potem dokładnie rozdzielić białek czy kwasów nukleinowych. Poza tym wędrówka jest dość szybka i trudno określić, kiedy zakończyć rozdział.

• Problemy występujące w elektroforezie swobodnej szybko rozwiązano przez zastosowanie nośnika, np. żelu lub bibuły. Gdy przyjrzymy się dokładnie ich strukturze, zauważymy, że jest podobna do gąbki. Dzięki temu cząsteczka wędrująca przez nośnik musi dosłownie przeciskać się przez dziurki nośnika (tzw. pory). Gdy zatrzymamy elektroforezę, rozdzielane cząsteczki pozostaną uwięzione na swoim miejscu i będzie można je stamtąd bez problemu odzyskać. Elektroforeza w żelu jest popularniejsza od elektroforezy na bibule, która wykazuje więcej szkodliwych oddziaływań z próbką. Spośród wielu typów żeli (agarozowe, dekstranowe, krzemionkowe itd. - szcegóły w Tabeli 1) szczególnie popularne są żele poliakrylamidowe.

• Elektroforeza w żelu wygląda następująco: na początek żel zanurza się w elektrolicie. W żelu są wąskie studzienki, do których wprowadza się próbkę. Następnie z dwóch stron żelu podłącza się elektrody i przeprowadza rozdział. W odpowiednim momencie należy wyłączyć prąd, aby cząsteczki nie wyszły poza żel.

• żel	jednostka budulcowa
  poliakrylamidowy	akrylamid i N,N'-metylenobisakrylamid
  agarozowy	D-galaktoza i 3,6-anhydro-L-galaktoza
  dekstranowy	α-D-glukoza

• Tabela 1. Żele używane w elektoforezie

Elektroforeza w żelu

Elektroforeza kwasów nukleinowych

• Do elektroforezy krótkich łańcuchów kwasów nukleinowych używa się żelu poliakrylamidowego, natomiast do dłuższych łańcuchów – żeli agarozowych, które mają większe pory. Próbkę zawierającą DNA lub RNA umieszcza się w studzience przy katodzie – kwasy nukleinowe są naładowane ujemnie, więc poruszają się do anody. Odległość, jaką przebędą, zależy tylko od ich masy (stosunek ładunku do masy jest dla kwasów nukleinowych zawsze taki sam, więc w elektroforezie swobodnej poruszałyby się z taką samą prędkością, jednak ponieważ używamy nośnika, cząsteczki większe trudniej przeciskają się przez sieć i w efekcie idą wolniej). Zatem krótkie fragmenty dojdą dalej niż długie.

• Elektroforezę kwasów nukleinowych wykorzystuje się do ich rozdziału oraz określania ich długości (Rysunek 5). Oczywiście DNA nie jest widoczne gołym okiem, więc po elektroforezie należy wybarwić żel np. bromkiem etydyny, który zwiąże się z DNA i będzie świecił w świetle ultrafioletowym.

Elektroforeza białek

Białka natywne

• Białka natywne to białka o takiej strukturze, jaką posiadają w żywych organizmach: są to liniowe cząsteczki, ale zwinięte w kłębek (jak na Rysunku 2). Mogą przez to sprawnie pełnić swoją rolę. Elektroforezę białek natywnych przeprowadzamy, gdy chcemy wyizolować aktywne białka, które zamierzamy później do czegoś wykorzystać. Elektroforeza pozwala odizolować je od niepotrzebnych cząsteczek. Studzienki, w których umieszcza się próbki, znajdują się na środku żelu, gdyż natywne białka mogą być naładowane dodatnio lub ujemnie, więc wędrują albo do katody, albo anody (Rysunek 6). Jeśli znamy ładunek poszukiwanego białka, studzienki możemy utworzyć przy elektrodzie przeciwnej do tej, do której ono wędruje.

• Białka również należy wybarwić. Popularnymi barwnikami są Coomassie Blue, srebro czy barwniki fluorescencyjne.

Białka zdenaturowane

• Białka zdenaturowane to takie, które „rozwinięto”. Jest to jakby łańcuszek. Takie rozwinięcie uzyskuje się działając na białka związkami zwanymi denaturatami: mocznikiem, 2-merkaptoetanolem, ditiotreitolem czy dodecylosiarczanem sodu (tzw. SDS). SDS ma tę dodatkową zaletę, że tworzy jakby „płaszcz” na powierzchni rozwiniętej cząsteczki białka. SDS ma ujemny ładunek i bardzo silnie wiąże się z białkiem. Zatem całe białko zyskuje duży ładunek ujemny; nawet jeśli wcześniej miało ładunek dodatni, to zmiana ładunku jest tak duża, że nie ma to znaczenia. Takie opłaszczone SDS-em białko w elektroforezie zachowuje się dokładnie jak kwasy nukleinowe: stosunek ładunku do masy jest zawsze taki sam (jedna cząsteczka SDS przypada na dwa aminokwasy), więc rozdział zachodzi tylko ze względu na masę. Barwienie przeprowadza się tymi samymi odczynnikami, co przy elektroforezie białek natywnych.

Ogniskowanie izoelektryczne (izoogniskowanie)

• Ogniskowanie izoelektryczne jest szczególnym przypadkiem elektroforezy białek natywnych, w którym białka są rozdzielane ze względu na ich punkt izoelektryczny (pI). Punkt izoelektryczny to takie pH, w którym wypadkowy ładunek białka wynosi 0. Ogólnie można powiedzieć, że im pH niższe, tym ładunek białka bardziej dodatni, a im pH wyższe, tym ładunek bardziej ujemny. W pewnym pośrednim punkcie ładunek musi być równy 0.
• Nośnikiem w ogniskowaniu izoelektrycznym jest zazwyczaj żel poliakrylamidowy, w którym pH przy anodzie jest niskie, na odcinku między anodą a katodą rośnie, a przy katodzie jest największe (w normalnej elektroforezie pH jest wszędzie takie samo). Jeśli więc na środku żelu wprowadzimy próbkę i włączymy prąd, białka naładowane dodatnio powędrują do katody. Jednak ponieważ pH rośnie w kierunku katody, to ładunek białka będzie spadał, a kiedy osiągnie 0, białko zatrzyma się w pH równym swojemu pI (nie będzie już jonem, więc nie będzie poruszało się w polu elektrycznym). Tak samo białka, które na początku były naładowane ujemnie, wędrując ku anodzie staną się coraz bardziej dodatnie, aż zyskają ładunek 0 i zatrzymają się. Zatem w przeciwieństwie do elektroforezy w stałym pH nie trzeba obawiać się, że rozdział nie zostanie zatrzymany w odpowiednim czasie i białka wyjdą poza żel.

Elektroforeza dwuwymiarowa

• Elektroforeza dwuwymiarowa wykorzystuje dwie spośród poznanych wyżej technik: ogniskowanie izoelektryczne oraz elektroforezę białek w warunkach denaturujących (Rysunek 7).

• Najpierw przeprowadza się ogniskowanie izoelektryczne, a następnie zatapia się żel z ogniskowania w żelu poliakrylamidowym z dodatkiem SDS i przykłada prąd prostopadle do żelu z ogniskowania. W ten sposób najpierw białka są rozdzielane ze względu na różne pI, a w drugim etapie białka o tym samym pI są rozdzielane ze względu na masę.

• Stosując elektroforezę dwuwymiarową zyskuje się niespotykaną w innych metodach elektroforetycznych rozdzielczość (na jednym żelu można zobaczyć do dziesięciu tysięcy białek).

Zrób to sam

• Zanim zaproponuję samodzielne wykonanie elektroforezy w warunkach domowych, polecam odwiedzenie strony uniwersytetu w Utah, gdzie można wykonać elektroforezę w wirtualnej rzeczywistości (trzeba choć trochę znać angielski).

• Elektroforezę możesz również przeprowadzić w domu. Przepis można ściągnąć ze strony Szkoły Festiwalu Nauki (plik zip).

Bibliografia

1. Biochemia, Berg, Tymoczko, Stryer, PWN 2005, s. 83-87

2. Analiza instrumentalna w biochemii. Wybrane problemy i metody instrumentalnej biochemii analitycznej, A. Kozik, M. Rąpała-Kozik, I. Guevara-Lora, Wydawnictwo EJB 2001, s. 219-259

3. http://www.sfn.edu.pl

4. http://en.wikipedia.org/wiki/Gel_electrophoresis

5. http://www.rcsb.org