Articles wiki

Odkrycie Treg, czyli po nitce do kłębka...

Po raz pierwszy istnienie regulatorowych limfocytów T stwierdzono w 1969r. w Archi Center Research Institute w Nagoi, w Japonii. Doświadczeniem, które przyczyniło się do wysnucia hipotezy o ich istnieniu było usunięcie z mysiego, żeńskiego noworodka grasicy. Operacja taka niespodziewanie spowodowała zanik grasicy. Po wnikliwym zbadaniu okazało się, że zanik grasicy był spowodowany atakiem własnych komórek odpornościowych myszy. Co więcej, okazało się, że po wstrzyknięciu zwierzętom limfocytów T choroba ulegała regresji. Naukowcy stwierdzili, że w puli limfocytów T znajdują się tajemnicze komórki pomagające w hamowaniu odpowiedzi immunologicznej. Komórki te nazwano supresorowymi limfocytami T. Przez wiele kolejnych lat limfocyty Treg popadły w niełaskę wśród naukowców, gdyż nie dało się ich jednoznacznie zidentyfikować (np. znaleźć marker specyficzny marker powierzchniowy) i odseparować od całej reszty limfocytów. Wtedy rozpoczął się wyścig o znalezienie powierzchniowego markera, który w jednoznaczny sposób charakteryzowałby Treg. Dopiero w 1995r. Sakaguchi z Uniwersytetu w Kioto wykazał, że poszukiwanym markerem jest białko CD25 (receptor dla interleukiny 2) i że Treg należą do subpopulacji TCD4+

Jak wykazano obecność markera CD25 na powierzchni limfocytów Treg?

W celu ostatecznego potwierdzenia, że marker CD25 jednoznacznie charakteryzuje Treg, przeprowadzono następujące doświadczenie:

1. Od zdrowych myszy wyizolowano pulę limfocytów

2. Usunięto komórki CD4+ CD25+

3. Pozostałe limfocyty przeszczepiono myszom z genetycznym knockoutem (nie wytwarzały własnych limfocytów T)

W wyniku tych manipulacji, myszy po przeszczepach szybko zapadały na choroby autoimmunizacyjne, a co więcej ich przebieg był tym drastyczniejszy im więcej przeszczepiono limfocytów T pozbawionych puli CD4+CD25+. Nowe światło na funkcję regulatorowych limfocytów T rzuciło niedawne odkrycie, że komórki te (u myszy) zawierają ponadprzeciętną ilość wewnątrzkomórkowego białka – czynnika transkrypcyjnego – Foxp3. Po sztucznym wprowadzeniu Foxp3 za pomocą wektora retrowirusowego do zwykłych limfocytów okazywało się, że przekształcały się one w limfocyty regulatorowe. Naukowcy z University of Washington na podstawie tych badań wywnioskowali, że Foxp3 jest czynnikiem przeprogramowującym limfocyty T w limfocyty regulatorowe.

Człowiek analogiem myszy?

Do niedawna badania nad Treg prowadzone były tylko i wyłącznie na myszach. Okazało się, że znane wcześniej naukowcom myszy „Scurfy”, charakteryzujące się chorobami autoimmunizacyjnymi, miały zmutowane formy białka Foxp3, co prowadziło do braku wykształcenia funkcjonalnych limfocytów regulatorowych T. Próby znalezienia analogicznego schorzenia u ludzi wskazały na rzadki defekt genetyczny o nazwie IPEX (immune dysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy, X-linked syndrome), czyli sprzężony z płcią zespół zaburzeń odporności, zaburzeń hormonalnych i enteropatii. Choroba ta ujawnia się tylko u chłopców, którzy posiadają jeden chromosom X ze zmutowanym genem. Jest to typowa choroba autoimmunizacyjna. W czasie jej trwania układ odpornościowy atakuje wiele własnych narządów, takich jak: tarczyca, trzustka, jelito. Gdy ostalono gen, którego mutacja wywołuje IPEX, stwierdzono, że jego produkt jest analogiem Foxp3

Nowo odkryte subpopulacje regulatorowych limfocytów T

Badania nad scharakteryzowaniem molekularnego wzorca powierzchniowego limfocytów T regulatorowych ciągle trwają i w ciągu ostatnich kilku lat odkryto również inne subpopulacje tych komórek:

• Nazwa	Markery powierzchniowe	Pochodzenie
  Treg	CD4+, CD25+, Foxp3+	Śledziona
  Tr1	CD4+, IL-10+, Foxp3-	Obwodowe narządy limfoidalne
  Th3	CD4+, TGF-β+	Obwodowe narządy limfoidalne

• Tabela 1. Charakterystyka nowoodkrytych subpopulacji limfocytów regulatorowych

Proces powstawania i dojrzewania limfocytów regulatorowych w grasicy

Proces dojrzewania Treg w grasicy jest mało poznany. Podejrzewa się, że największe znaczenie ma w nim interakcja pomiędzy cytotoksycznym receptorem charakterystycznym dla komórek T na komórkach CD4+CD25+ i antygenów własnych prezentowanych w kontekście MHC klasy II na komórkach rdzenia grasicy. Naukowcy uważają, że mechanizm dojrzewania nie różni się od dojrzewania innych limfocytów T, jednak że powinowactwo receptorów TCR na komórkach CD4+CD25+ do antygenów jest znacznie większe, niż na innych limfocytach. W procesie dojrzewania populacji limfocytów Treg CD4+CD25+ największą rolę odgrywają takie receptory i cytokiny jak: CCR8, CD28, CD40, B7.1, B7.2, IL-2 i TGF-β, które są niezbędne do prawidłowego ukształtowania i funkcjonowania tych komórek

Proces powstawania i dojrzewania limfocytów regulatorowych poza grasicą

Badania holenderskiej grupy badaczy pod przewodnictwem Taamsa wykazały, iż komórki regulatorowe mogą również powstawać poza grasicą [6]. Grupa ta izolowała komórki Treg z krwi obwodowej i sprawdzała ekspresję markerów. Okazało się, że wyizolowane limfocyty regulatorowe wykazują niską ekspresję markerów CD45RB, CD95 oraz małe stężenie Bcl-2 charakterystycznych dla limfocytów T wysoce zróżnicowanych w wyniku stymulacji kilkukrotnej tym samym antygenem. W doświadczeniu przeprowadzonym przez tą grupę, użyto wysoce zróżnicowane limfocyty T swoiste dla antygenu hemaglutyniny S1, które wykazywały ekspresję MHC klasy II i mogły prezentować sobie nawzajem antygen, w wyniku czego stawały się komórkami spełniającymi kryteria komórek CD4+CD25+ Treg. Wyniki tych badań wskazują na możliwość powstawania komórek CD4+CD25+ Treg na obwodzie w specyficznych warunkach, przy braku kostymulacji przez dojrzałe komórki APC (Antigen presenting cells). Co więcej doświadczenia przeprowadzone przez inną grupę naukowców [7] w warunkach in vitro na limfocytach mysich i ludzkich potwierdzają możliwość powstawania limfocytów Treg CD4+CD25+ z limfocytów T CD4+CD25–. Zauważyli oni, że w hodowli komórek T CD4+CD25– po zastymulowaniu ich TGF-β i IL-2 ulegają transformacji do komórek Treg CD4+CD25+ .

Mechanizmy regulacji odpowiedzi immunologicznej, czyli dyplomatyczne działania Treg....

Do tej pory poznano kilka mechanizmów regulacji odpowiedzi immunologicznej przez limfocyty regulatorowe:

1. Po pierwsze jest to aktywna inhibicja efektorowych limfocytów T poprzez oddziaływanie komórka - komórka. W badaniach in vitro stwierdzono, że za hamowanie efektorowych limfocytów T odpowiedzialne jest wydzielanie IL10 i TGF-β. Największe znaczenie odgrywa TGF –β , związany z błoną komórkową limfocytów Treg

2. Niepobudzone komórki Treg na swej powierzchni wykazują wysoką ekspresję receptora łańcucha a cytokiny IL-2 (CD25), dla łańcucha g IL-2 (CD122) oraz innych cząsteczek takich jak HLA-DR, CD45RO, wewnątrzkomórkowy receptor CTLA-4 (cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen 4) oraz CD134 (OX40). Jedną z niewielu uchwytnych morfologicznych zmian zachodzących podczas aktywacji limfocytów CD4+CD25+ poprzez receptor TCR jest wzrost ekspresji receptora CTLA-4, który ulega przemieszczeniu z cytoplazmy na powierzchnię komórki. Ligandem białka CTLA-4 znajdującego się na powierzchni aktywowanego limfocyta Treg jest receptor B7 na komórkach docelowych. Wynikiem połączenia się białka CTLA-4 z receptorem B7 jest spadek wytwarzania IL-2 przez limfocyty bezpośrednio poddane działaniu Treg. W następstwie obniżenia uwalniania IL-2 następuje spadek proliferacji pozostałych limfocytów.

3. Kolejnym czynnikiem któremu przypisuje się znaczenie supresyjne regulatorowych limfocytów CD4+CD25+ jest receptor GITR (glucocortocoid-induced tumor necrosis factor receptor). W badaniach in vitro [6] po zastosowaniu przeciwciał monoklonalnych blokujących receptor GITR nastąpiło osłabienie właściwości inhibicyjnych komórek Treg.

4.Innymi kandydatami receptorów odpowiedzialnych za supresję limfocytów efektorowych mogą być cząsteczki PD-1 oraz Notch. W dotychczasowych badaniach nie udało się jednoznacznie określić struktury i znaczenia tych receptorów w bezpośrednich interakcjach komórkowych. Stwierdzono jedynie, że u myszy transgenicznych z brakiem receptora PD-1 rozwija się autoimmunizacyjne zapalenie kłębuszków nerkowych, zapalenie stawów i autoimmunizacyjna kardiomiopatia rozstrzeniowa.

Dwustopniowa teoria działania Treg

Nie do końca poznanym mechanizmem jest to, w jaki sposób tak mało liczna populacja komórek jest w stanie nadzorować pozostałe komórki układu immunologicznego. Pewnym wyjaśnieniem może być teoria dwustopniowego działania Treg, zwana tolerancją zaraźliwą (infectious tolerance). Teoria ta dzieli mechanizm na dwa, sekwencyjnie występujące po sobie zdarzenia:

1. W pierwszym etapie komórki Treg CD4+CD25+ w kontakcie bezpośrednim z limfocytami T CD4+CD25– indukują ich anergię i uwalnianie przez nie IL-10 i TGF-β. W ten sposób powstają anergiczne limfocyty Tsup, zdolne do wydzielania IL-10 i TGF-β.

2. W drugim etapie powstałe uprzednio Tsup działają hamująco na kolejne limfocyty CD4+CD25–.

Dwustopniową teorię działania Treg ilustruje obrazek:

Powstała hipoteza była wynikiem obserwacji hodowli mieszanej limfocytów Treg CD4+CD25+ z limfocytami CD4+CD25–. Zaobserwowano mianowicie, iż po pewnym czasie z takiej hodowli można wyizolować limfocyty Treg CD4+CD25+, jak również Tsup, zdolne do hamowania świeżo wyizolowanych limfocytów CD4+CD25–. Co więcej w supernatantach pohodowlanych stwierdzono znaczne ilości IL-10 i TGF-β.

W przypadku badań in vivo mechanizm supresji jest dużo bardziej złożony, ponieważ zależy od immunogenności antygenu. W zakażeniach bakteryjnych następuje silna aktywacja wielu komponent układu immunologicznego, co niesie ze sobą zagrożenie powstania wstrząsu septycznego. W takiej sytuacji działanie limfocytów Treg musi objąć cały organizm, co może nastąpić jedynie poprzez sieć cytokin hamujących proces zapalny, IL-10 i TGF-β. W przypadku autoantygenów rola limfocytów Treg powinna się ograniczyć do neutralizacji komórek autoreaktywnych. Do takiej eliminacji limfocytów wystarczający może być kontakt bezpośredni z Treg, bez konieczności uruchamiania sieci cytokin.

Regulacja mechanizmu regulacji....czyli wpływ innych czynników na regulatorowe limfocyty T

Limfocyty regulatorowe Treg muszą być przygotowane na kilka możliwych scenariuszy. Musi więc istnieć mechanizm, który pozwoli m.in. rozróżnić własną florę bakteryjną w organizmie, od obcego patogenu, który wniknął do organizmu drogą skórną. Na typ reakcji który nastąpi największy wpływ ma środowisko, w którym komórki te po raz pierwszy będą miały do czynienia z antygenem. Naukowcy wyróżnili 3 główne klasy molekuł, które mają wpływ na sterowanie zachowaniem limfocytów Treg. Są to:

1. Cytokiny

---

Edit conflict - other version:

---

Wiele cytokin jest w stanie bezpośrednio wpływać na zachowanie Treg. Jedną z nich, najlepiej poznanych jest IL2, która, jak udowodniono w testach in vitro, powoduje zmniejszenie supresorowych właściwości Treg. Co więcej, udowodniono w badaniach na myszach bez receptora na IL2 lub bez IL2, które nie syntezowały własnych regulatorowych Treg i w większości cierpiały na śmiertelne choroby autoimmunologiczne. Innymi ważnymi w regulacji aktywności Treg są IL15, IL7 i IL4. Wykazano również, że IL1, IL6 i IL12, które są produkowane przez dojr

---

Edit conflict - your version:

---

Wiele cytokin jest w stanie bezpośrednio wpływać na zachowanie Treg. Jedną z nich, najlepiej poznanych jest IL2, która, jak udowodniono w testach in vitro, powoduje zmniejszenie supresorowych właściwości Treg. Co więcej, udowodniono w badaniach na myszach bez receptora na IL2 lub bez IL2, które nie syntezowały własnych regulatorowych Treg i w większości cierpiały na śmiertelne choroby autoimmunologiczne. Innymi ważnymi w regulacji aktywności Treg są IL15, IL7 i IL4. Wykazano również, że IL1, IL6 i IL12, które są produkowane przez dojrzałe komórki APC mogą oddziaływać bezpośrednio na Treg i powodować zwiększoną odpowiedź na IL2 i wzmożoną proliferację Treg.

2. Cząsteczki współstymulujące

Innym opisywanym mechanizmem zachodzącym po bezpośredniej interakcji między komórką APC, a Treg. Dojrzałe APC charakteryzują się wysokim poziomem ekspresji molekuł CD40, CD80/86, które mogą pobudzać do działania limfocyty Treg. W badaniach in vivo stwierdzono, że myszki z deficytem CD86 i CD40 syntetyzują znacznie mniejszą ilość Treg, niż myszy o dzikim genotypie. Fakt ten sugeruje, że CD80 i CD40 dodatnio wpływają na proces proliferacji Treg. Podsumowując, zarówno cytokiny, jak i cząsteczki współstymulujące, które są obecne na powierzchni dojrzałych APC mogą wpływać na funkcjonowanie Treg, poprzez stymulację dojrzewania, proliferacji i stymulując ich hamujące działanie.

3. Sygnalizacja za pomocą TLRs (Toll like receptors)

Sygnalizacja wewnątrzkomórkowa zachodząca z udziałem TLR, czyli receptorów rozpoznających molekularne wzory patogenności, odgrywa znaczącą rolę w zapoczątkowaniu odpowiedzi immunologicznej. Receptory TLR 1, 2 i 6 są znajdowane zarówno na Treg, jak i na efektorowych limfocytach T. Jednak, po wnikliwej analizie okazało się, że Treg wykazują dużo wyższą ekspresję TLR4, 5, 7 i 8 niż efektorowe limfocyty T. Największy wpływ na proliferację innych, nieaktywnych limfocytów Treg miał TLR2, pochodzący od innych Treg. Co więcej udowodniono, że współoddziaływanie przez TLR2 i TCR powoduje wzmocnienie odpowiedzi Treg

Terapeutyczne zastosowania limfocytów regulatorowych

Najbardziej oczywistym zastosowaniem limfocytów Treg jest zwiększenie ich aktywności w celu zwalczania chorób autoimmunizacyjnych, takich jak stwardnienie rozsiane, reumatoidalne zapalenie stawów, czy cukrzyca typu I. Co więcej, komórki te dają olbrzymią nadzieję na rozwiązanie problemu odrzucania przeszczepów. Na przeciwległym biegunie znajdują się choroby, które są spowodowane zbyt dużą ilością komórek regulatorowych, jak np. nowotwory. Wykazano bowiem, że komórki nowotworowe stymulują migrację Treg w pobliże guza, co powoduje obniżenie aktywności odpowiedzi immunologicznej i rozpoznanie komórek guza jako własnych. Era opracowania leków, które zwiększałyby lub zmniejszały subpopulacje komórek Treg właśnie się rozpoczyna.... Co może napawać optymizmem jest fakt odkrycia możliwości generacji i ekspansji limfocytów Treg CD4+CD25+ z limfocytów T CD4+CD25- po zasymulowaniu TGF-β i IL2, który został opisany wcześniej.

Bibliografia:

1) Peacekeepers of the Immune System, Scientific American Magazine, Listopad 2006

2) Regulatory T cells and toll-like receptors: regulating the regulators , Roger Sutmuller, Anja Garritsen, Gosse J Adema, Annals of the Reumatic Diseases, Grudzień 2007

3) Regulatory T cells, tumour immunity and immunotherapy, Weiping Zou, Nature Reviews Immunology, kwiecień 2006

4) CD4+CD25+ T regulatory cells: their physiology and role in modulating immune response. Przemysław Lewkowicz , Natalia Lewkowicz , Henryk Tchórzewski, Zakład Immunologii Klinicznej, Instytut Centrum Zdrowia Matki Polki w Łodzi, Zakład Periodontologii i Chorób Błony Śluzowej Jamy Ustnej, Uniwersytet Medyczny w Łodzi PubMed

5) Human anergic/suppressive CD4+CD25+ T cells: a highly differentiated and apoptosis-prone population. Taams L.S., Smith J., Rustin M.H., Salmon M., Poulter L.W., Akbar A.N.: European Journal of Immunology, 2001; 31

6) Natural and induced CD4+CD25+ cells educate CD4+CD25- cells to develop suppressive activity: the role of IL-2, TGF-β, and IL-10. Zheng S.G., Wang J.H., Gray J.D., Soucier H., Horwitz D.A., Journal of Immunology, 2004 PubMed

7) Regulatory T cells: potential target in anticancer immunotherapy. Juang CM, Hung CF, Yeh JY, Horng HC, Twu NF, Cheng MH, Wen KC, Yuan CC, Chao KC, Wu TC, American Journal of Obstetrics and Gynecology, 2007 PubMed

8) Mapa chromosomu X z zaznaczoną mutacją występującą przy defekcie IPEX

---

---

End of edit conflict

---